茄子（Solanum melongena）是亚洲和非洲许 多国家重要的蔬菜作物之一，在我国各地普遍栽 培。茄子作为一种喜温性蔬菜，大多茄子品种不 抗寒。近年来，人们采用节能型塑料日光温室 和塑料大棚在冬春反季节栽培茄子。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

将T40茄子6叶龄幼苗放在3 ℃ 低温培养箱中进行低温处理，于 0、2、6、12 h 分别 取样。将茄子第 5 片真叶取下立即投入液氮中， −80 ℃保存备用。

1.1.2 试剂与菌株

ExTaq、pMD18-T、T4 DNA 连接酶载体购自 TaKaRa 公司；柱式 DNA 胶回收 试剂盒购自北京天恩泽基因科技有限公司；SYBR ExScriptTM RT-PCR 购自 TaKaRa 公司；引物由上 海铂尚生物技术有限公司合成。通用 RNA 提取试 剂盒 R1051 购自广州东盛生物科技有限公司。 E. coli DH5α 菌株由本实验室培养并保存。其余为 国产分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 茄子

CBF基因的克隆与生物信息学分析 将白菜（Brassica rapa）CBF 基因序列（登录号： KJ013591.1）搜索茄子基因组 DNA 序列，用 softberry 网站在线预测基因软件 FGENESH 对这 段 DNA 序列进行基因预测，找到 CBF 基因的编码区。参考茄子 EST 序列，通过与小白菜（Brassica campestris）、番茄（Solanum lycopersicum）、马 铃薯（Solanum tuberosum）CBF 基因序列比对确 定茄子 CBF 的开放型阅读框区域（Open Reading Frame, ORF），并在此序列基础上设计 ORF 上下 游引物和荧光定量引物（表 1）。

参考 RNA 提取试剂盒步骤提取茄子叶片总 RNA，将 500 ng RNA 逆转录合成 cDNA。吸取 cDNA 1 μL 作为模板进行 PCR 扩增，25 μL PCR 反应体系包含 2.5 μL Ex buffer，2 μL dNTPs，0.2 μL ExTaq，0.5 μL 引物，1 μL cDNA，ddH2O 补 充至 25 μL。扩增程序为 94 ℃预变性 3 min；35 个扩增循环的 94 ℃变性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min；最后 72 ℃继续延伸 7 min。然后， 将 PCR 产物用 1%的琼脂糖凝胶电泳检测，将含 有目的条带片段割胶回收，再连接 pMD18-T 载 体，转化到大肠杆菌感受态细胞中，挑选阳性克 隆送到铂尚生物技术有限公司进行测序。

2 结果与分析

NCBI 上用白菜 CBF 基因序列（登录号： KJ013591.1）搜索茄子 Whole-genome shotgun contigs ，发现该序列与茄子 contig: Sme2.5_ 04750.1_1（登录号：BAUE01047055.1）相似度 最高，达 71%。在 softberry 网站，以番茄基因组 DNA 为参照，用 FGENESH 软件对该序列进行基 因预测，在 1023~2137 bp 之间有 1 个没有内含子 的基因。将该基因序列与 Genbank 登录的基因组 序列，以及 3 个 EST 序列（EST1：FS056692.1； EST2：JZ716995.1；EST3：FS057826.1）进行比 对，设计 ORF 引物 CBF-U 与 CBF-D。以茄子叶片 cDNA 为模板，用 CBF-U 和 CBF-D 引物进行扩增，获得长约 700 bp 的片段。经回收、测序长 699 bp，与基因组 DNA 序 列完全一致。将此序列及其编码的氨基酸序列与 其他物种 CBF 比较，发现有较高同源性，该序列 （ Solanum melongena ， AVC18973.1 ）与辣椒 （Capsicum annuum，NP_001311786.1）、烟草 （Nicotiana tabacum，NP_001312746.1）、番茄（Solanum lycopersicum，XP_004234350.1）、马 铃薯（Solanum tuberosum，ACJ26754.1）和葡萄 （Vitis vinifera，XP_002280097.1）的 CBF 蛋白同 源性为 71.17%、70.09%、65.93%、63.76%、62.84% 。因此确认获得了茄子 CBF 基因全长 cDNA 序列，将其命名为 SmCBF，GenBank 登录 号为 KY780486.1。


3 讨论

低温逆境是影响植物生长发育和分布的主要因素之一，每年因寒害造成的园艺作物的减产和 品质下降是目前园艺植物生产中亟待解决的一大 难题。植物的抗寒性一般受多基因控制，且与品 质优劣性状紧密连锁，因此采用常规杂交育种很 难提高植物抗寒性。利用基因工程改良植物的抗 逆性为抗性育种开辟了新途径，因此抗逆基因的 克隆与分析就显得极为重要。



 

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