幽门螺杆菌是胃炎、消化性溃疡和胃癌的重要致病因子。目前，临床对幽门螺杆菌感染治疗大多是经验用药，随着感染人群中幽门螺杆菌耐药菌株的 不断增加，经验性用药治疗失败率越来越高。为指导 Ⅰ期临床用药，提高幽门螺杆菌治疗精准性、敏感性， 迫切需要实验室提供幽门螺杆菌培养和药敏 结 果。 由于幽门螺杆菌需要在微需氧的特殊环境和较高营 养条件生长，实验室培养成功率较低，使得许多医院 都不愿开展幽门螺杆菌培养。近几年来国内许多第 三方医学检验机构针对临床需求，纷纷开展幽门螺杆 菌培养和差异化服务。

１ 材料与方法

１．１ 仪器与试剂

１．１．１ 培养液种类

幽门螺杆菌转运培养基（固－液 双相）购自珠海经济特区益民生物工程制品厂（批号： ２０１８０７３０）；血琼脂平板购自郑州安图生物工程股份 有限公司（批号：２０１８０７２６Ｂ）；苛养菌药敏琼脂平板购 自 郑 州 安 图 生 物 工 程 股 份 有 限 公 司 （批 号： ２０１８０７１９Ｂ）。

１．１．２ 鉴定试剂

ＶＩＴＥＫ ＭＳ－ＣＨＣＡ 基质购自生 物梅里埃公司（批号：１００６０６２９８０）；尿素酶购自杭州 滨和微生物试剂有限公司（批号：１７０１０３）；触酶和氧 化酶购自重庆庞通医疗器械有限公司（批号分别为： １８Ｄ０８０４和１８Ｄ１８０５）。

１．１．３ 仪器

梅里埃质谱仪 ＶＩＴＥＫ ＭＳ购自生物 梅里埃公司；ＴＤＲ－Ｙ１００型微需氧培养仪和微需氧培 养气体（１０％二氧化碳＋１０％氢气＋氮气平衡气）购 自湖南长沙天地人生物科技有限公司；标本运输箱购 自广州赛信冷链冷藏科技有限公司；九州网址YXQ-75SII立式压力蒸汽灭菌器（非医用）； ＨＳＸ－２５０型电热恒温恒湿箱购自中仪国科（北京）科 技有限公司；ＤＷ－８６Ｌ３３８型－８０ ℃超低温保存箱购 自青 岛 海 尔 特 种 电 器 有 限 公 司；ＤＷ－ＹＷ１６６Ａ 型 －２５ ℃冰箱购自中科美菱低温科技有限责任公司； ＤＷ－ＹＬ４５０型４ ℃冰箱购自中科美菱低温科技有限 责任公司；ＢＳＣ－１５００ＩＩＢ２－Ｘ型生物安全柜购自山东济 南鑫贝西生物技术有限公司；ＣＸ２１ＦＳ１Ｃ 型生物显微 镜和 ＢＸ４３Ｆ型摄像显微镜购自日本奥林巴斯公司。

１．２ 方法

１．２．１ 样本制备原代幽门螺杆菌标准菌株

ＡＴＣＣ４３５０４以 ＴＳＢ基质配制浓度为０．５麦氏浊度的 菌悬浮液（约１×１０８ ＣＦＵ／ｍＬ）。按以下步骤进行连 续稀释，（１）１∶００稀释：吸取上述细菌悬液０．１ ｍＬ 加入９．９ｍＬＴＳＢ中。（２）再１∶１００稀释：吸经（１）稀 释后悬液０．１ｍＬ 加入９．９ｍＬ ＴＳＢ 中。（３）再１∶ １００稀释：吸经（２）稀释后悬液０．１ｍＬ 加入９．９ｍＬ ＴＳＢ中。此 时 幽 门 螺 杆 菌 浓 度 为 （１００±１０）ＣＦＵ／ ｍＬ，然后将此浓度的幽门螺杆菌菌液加入运输培养 基中，每支１ｍＬ，共７５支。此试验重复３次。

１．２．２ 样本包装

将标本放置于特殊包装箱中。包 装箱必须具备，
（１）主容器用足量的吸附性材料进行 包裹，以便在发生渗漏时可以吸收所有液体。
（２）中 层包装，为第２层耐用、水密性、防渗漏的包装，把主 容器装入其中并对其起保护作用。
（３）外包装，中层 包装置于外包装内，并加垫适宜的缓冲材料。外包装 应能保护其内容物在运输时不受外界的影响，如遭受 物理性损坏。外层容器的最小一面的尺寸≥１０ｃｍ× １０ｃｍ。将制备完成的样本放置于特殊包装箱中进行 相关贮存试验。

１．２．３ 样本贮存

把已接种菌液的幽门螺杆菌运输 培养基分别置于４、２５、３５、－２５、－８０ ℃环境中，分别 存放６．０、１２．０、２４．０、４８．０ｈ后进行微需氧培养。

１．２．４ 样本的运输

汽车运输：将标本置于４ ℃冷 链运输箱由本公司冷链运输车运送至杭州金域医学 检验所样本接收组，并及时递交至微生物室，所有样 本存放总时间为７．０ｈ后接种。在车上时间为６．０ｈ。 火车运输：将标本置于４ ℃冷链运输箱，通过安检并 进行交接登记。当日上午约９：００从杭州托远，至下 午１５：００左右样本到达广州高铁站，由广州运务组提 货，在１６：００前交接进入广州金域标本组并及时递交 至微生物室，所有样本存放总时间为７．０ｈ后接种，在 车上时间约为６．０ｈ。飞机运输：将标本置于４ ℃冷 链运输箱，通过安检并进行交接登记，由杭州经航空 运送到达广州白云机场，并及时递交至微生物室，所 有样本存放总时间为７．０ｈ后接种。在空中时间约为 ２．５ｈ。

２ 结　　果

固体培养到第３天时，幽门螺杆 菌生长良好，哥伦比亚血琼脂平板上见透明、针尖样 菌落形态；液体培养第３天时可见培养基明显浑浊， 涂抹少量菌液于无抗菌药物的哥伦比亚血琼脂平板 培养，肉眼未见污染菌生长，并有透明、针尖样的菌落长出；在无菌生理盐水中：革兰染色后细菌为革兰阴 性，固体培养基中的幽门螺杆菌为螺旋状、海鸥状、ｓ 状弯曲菌或短杆菌；液体培养基中的幽门螺杆菌则多 为螺旋短杆状，亦见部分长丝状细菌，有的互相缠绕 聚集成团，有的散在分布，革兰染色结果见图１

样本贮存温度与存放时间对结果有非常显著性影 响。在２４．０ｈ内相同贮存时间以贮存４ ℃时培养阳 性率最高（４０．４％±５．１％），与其他各组比较差异有 统计学意义 （Ｐ＜０．０５）；在 贮 存 ６．０ｈ 以 内 以 贮 存 ２５ ℃时阳性率最高（７１．２％ ±８．１％），与 ３５、－２５、 －８０ ℃比较，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。不同贮 存时间以－８０ ℃结果最稳定，结果见表１。

３ 讨　　论 　　

幽门螺杆菌为革兰染色阴性无芽胞、呈螺旋状弯 曲的杆菌，不仅寄生于胃肠道，而且在口腔及呼吸系 统均分离到细菌，在人群中感染率达５０％以上。据报 道，幽门螺杆菌感染是消化系统慢性炎症、胃部溃疡、 胃黏膜淋巴组织异常和淋巴瘤的主要致病菌和胃癌 的一级致癌因子。目前对幽门螺杆菌感染诊断方法种类众多，不同方法检出的阳性率差异明显，有许 多确定性方法如病理检查、基因诊断等。但如果进 行致病机制、细菌分型、耐药菌株、疫苗制备等研究， 幽门螺杆菌培养法是“金标准”。



 

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