土霉素是１种广谱抗生素，对立克次体属、支 原体属等 多 种 致 病 菌 具 有 强 的 抗 菌 作 用。然 而， 由于长期以 来 土 霉 素 的 广 泛 应 用，临 床 常 见 病 原 菌，例如葡萄 球 菌 等 革 兰 阳 性 菌 及 多 数 革 兰 阴 性 杆菌，对土霉素耐药现象严重。土霉素属于四环 素类的抗生素，其性质稳定，由于大量使用导致环 境中过多残留（土壤甚至海洋），且不易被降解，造 成环境中药物的严重污染。环境中的土霉素极 易引起耐药菌的产生，对农作物、牲畜乃至人类产 生不利影响，人 类 急 需 寻 求１种有效的方法对环 境中的土霉素进行降解。

1 实验部分

１．１ 仪器与试剂

超 净 工 作 台 （苏 净 集 团 安 泰 公 司 ）；ＺＳＤ－ Ａ１１６０全自动新 型 生 化 培 养 箱（上海智城分析仪 器有限公司）；上海博讯YXQ-75SII型立式压力蒸汽灭 菌锅 （上 海 博 讯 实 业 有 限 公 司 医 疗 设 备 厂 ）； ＬＡＢＯＲＯＴＡ ４０００－ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ 旋 转 蒸 发 仪 （德 国 Ｈｅｉｄｏｐｈ公司）；ＡＬ１０４万分 之 一 电 子 天 平（瑞 士 Ｍｅｔｔｌｅｒ－Ｔｏｌｅｄｏ公 司）；ＪＥＯＬＪＮＭ－ＥＣＰ６００ 型 核磁共振波谱 仪（５００ ＭＨｚ）（日本 电 子 株 式 会 社）； ＡｇｉｌｅｎｔＤＤ２５００ ＭＨｚ（安捷伦科技有限公司）； ＴｈｅｒｍｏＤＳＱＥＩ－ｍａｓｓ型质谱仪（美国 Ｔｈｅｒｍｏ公 司）；高效液相色谱仪 ＨｉｔａｃｈｉＬ－２０００ ＨＰＬＣ，Ｈｉ－ ｔａｃｈｉＬ－２５４５检测器（日本 Ｈｉｔａｃｈｉ公司）；Ｋｒｏｍａ－ ｓｉｌＣ１８柱 （５μｍ，２５０ ｍｍ×１０ ｍｍ，瑞 典 Ｅｋａ 公 司）；Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ－２０ 凝 胶 柱 色 谱 填 料 （Ａｍｅｒ－ ｓｈａｍ 公司）；硅胶２００～３００目（青岛 海 洋 化 工 有 限公司）；色谱 甲 醇（天 津 四 友 精 细 化 工 公 司）；土 霉素（上海麦克林）。

１．２ 菌株

真菌Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓｌｕｎａｔｕｓ（ＴＡ２６－４６）分离 自 中国广西涠洲岛珊瑚礁的海葵（样品编号 ＧＸＷＺ－ ２６），根据形态、理化特征及分子生物学方法，鉴定 该 菌 株 为 Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓｌｕｎａｔｕｓ，Ｇｅｎｅｂａｎｋ 登 录 号：ＪＮ９４３４６２，现保藏于中国海洋大学海洋药物教 育部重点实验室。－８０ ℃超低温保存。

１．３ 培养基

（１）ＹＴＳ 液 体 培 养 基：海 盐 ３３ｇ／Ｌ，葡 萄 糖 ２０ｇ／Ｌ。
（２）ＰＹＧ 液体 培 养 基：酵 母 膏１０ｇ／Ｌ，蛋 白胨１０ｇ／Ｌ，葡萄糖２０ｇ／Ｌ，海盐３３ｇ／Ｌ。
（３）甘 油培养 基：甘 油 ２０ｇ／Ｌ，酵 母 膏 １０ｇ／Ｌ，蛋 白 胨 １０ｇ／Ｌ，海盐３３ｇ／Ｌ。
（４）淀粉 培 养 基：可 溶 性 淀 粉１０ｇ／Ｌ，蛋白胨１０ｇ／Ｌ，海盐３３ｇ／Ｌ。
（５）甘露 醇培养基：甘露醇２０ｇ／Ｌ，麦芽糖２０ｇ／Ｌ，葡萄糖 １０ｇ／Ｌ，谷氨酸钠１０ｇ／Ｌ，酵母膏６ｇ／Ｌ，磷酸二氢 钾０．５ｇ／Ｌ，硫酸 镁（ＭｇＳＯ４ ·７Ｈ２Ｏ）０．３ｇ／Ｌ，海 盐３３ｇ／Ｌ。（６）磷酸盐培养基：酵母膏３．５ｇ／Ｌ，葡 萄 糖 ２０ ｇ／Ｌ，蛋 白 胨 ３．５ ｇ／Ｌ，磷 酸 氢 二 钠 （Ｎａ２ＨＰＯ４·１２Ｈ２Ｏ）１．２ｇ／Ｌ，氯 化 铵 ５ｇ／Ｌ，海 盐３３ｇ／Ｌ。
（７）合成培养基：葡萄糖２０ｇ／Ｌ，硫酸 铵２ｇ／Ｌ，磷 酸 二 氢 钾 １ｇ／Ｌ，硫 酸 镁 （ＭｇＳＯ４ · ７Ｈ２Ｏ）１ｇ／Ｌ，氯化 钠１ｇ／Ｌ，碳 酸 钙２ｇ／Ｌ，海 盐 ３３ｇ／Ｌ。
（８）ＰＤＡ 培养 基：马 铃 薯２００ｇ／Ｌ，葡萄 糖２０ｇ／Ｌ，海盐３３ｇ／Ｌ。
（９）察氏培养基：硝酸钠 ３ｇ／Ｌ，磷酸氢二钾１ｇ／Ｌ，硫酸镁（ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ） ０．５ｇ／Ｌ，氯化钾０．５ｇ／Ｌ，硫酸亚铁０．０１ｇ／Ｌ，蔗糖 ２０ｇ／Ｌ，琼脂２０ｇ／Ｌ，海盐３３ｇ／Ｌ。ＰＤＡ 斜面培养 基：马铃薯２００ｇ／Ｌ，葡萄糖２０ｇ／Ｌ，琼脂２０ｇ／Ｌ，海盐３３ｇ／Ｌ。

１．４ 土霉素生物转化与产物分离

在无菌条件下，将菌株Ｃ．ｌｕｎａｔｕｓ（ＴＡ２６－４６） 在ＰＤＡ 斜面培养基中２８℃培养７ｄ。加入１０ｍＬ 无菌人工海 水，刮 下 斜 面 的 孢 子。固 体 培 养 基 平 板转 化 时，在 每 个 平 板 中 加 入 ２００μＬ 浓 度 为 ２５ｍｇ／ｍＬ的土霉素 溶 液（使 用 丙 酮 溶 解）。待固 体培养基冷却至４０ ℃时，向每个平板倒入２０ｍＬ 培养基，轻轻混匀。吸取２００μＬ 孢子液涂布至培 养基平板，２８ ℃静置培养２１ｄ；发酵结束后，适量 的乙酸乙酯萃取３次，ＨＰＬＣ进行分析检测。 土霉素的生物转化产物大规模制备采用察氏 固体培养基，共８００个平板，２８ ℃静置培养２１ｄ。 发酵结束后，用乙酸乙酯萃取３次，合并萃取液蒸 干得浸膏５．１ｇ。经硅 胶 柱 层 析 分 离（石 油 醚－乙 酸乙酯，体 积 浓 度 １０％ ～１００％），获得 ３ 个 组 分 （Ｆｒ．１～Ｆｒ．３）。Ｆｒ．２经过半制备型 ＨＰＬＣ纯化， 获得化合物２（５．３ｍｇ）和３（３．８ｍｇ）。

１．５ 生物活性测试

采用微量稀释法对化合物进行抗细菌活性 测试。测试菌株包括：大肠杆菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ、 白色葡萄球菌Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｌｂｕｓ、金黄色葡萄 球菌Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ 和铜 绿 假 单 胞 菌（绿 脓杆菌）Ｐｓｍｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ。环丙沙星为阳 性对照，ＤＭＳＯ 为阴性对照，细菌培养基为空白对照。２８ ℃恒温培养２４ｈ，使用酶标仪测试６２０ｎｍ 波长处 的 吸 光 度，获 得 化 合 物 的 最 小 抑 菌 浓 度 （ＭＩＣ）。

２ 结果与讨论

用９种不同的培养基对Ｃ．ｌｕｎａｔｕｓ（ＴＡ２６－４６） 进行土 霉 素 转 化 条 件 筛 选。ＨＰＬＣ 的 分 析 条 件： ＫｒｏｍａｓｉｌＣ１８柱，流动相为甲醇（Ｂ）－水（Ａ），梯度 洗 脱：０～５ｍｉｎ，５％ Ｂ；５～１５ｍｉｎ，５％～２０％ Ｂ；１５～ ３０ｍｉｎ，２０％～３０％ Ｂ；３０～３５ｍｉｎ，３０％～１００％ Ｂ； ３５～６０ｍｉｎ，１００％ Ｂ。流速为２ｍＬ／ｍｉｎ；检测波长 ２１０ｎｍ；进样量２０μＬ。ＨＰＬＣ指纹谱图分析表明， 在察氏固体培养基（Ｓ１０）中获得了较好的转化效果 （见图１）。


３ 结论

本研究利 用 海 洋 真 菌 Ｃ．ｌｕｎａｔｕｓ（ＴＡ２６－４６） 成功地对土霉 素 进 行 了 生 物 转 化，获 得 了２个 未显示抗菌活性的降解产物，表明海洋来源真菌Ｃ． ｌｕｎａｔｕｓ可有效降解四环素类抗生素土霉素，为环 境中土霉素的生物降解研究提供了参考资料。

 

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