酱油是传统发酵调味品，具有悠久的历史，深受我 国、日韩和 东 南 亚 各 国 人 民 的 喜 爱。米 曲 霉 是 酱 油酿造中最重要的微生物，菌丝生长迅速，成熟后呈现 黄 绿 色 孢 子，具有优良的胞外酶系分泌和食品安全性，主 要 产 生 蛋 白 酶、淀 粉 酶、糖 化 酶、纤 维 素 酶 等。米曲霉蛋白酶根据酶切方式可分为内切酶和外切酶两大类，其中内切酶包括中性、碱性、酸性蛋白酶， 外切酶包括羧肽酶和氨肽酶。

１ 材料与方法

１．１ 材料与试剂

１．１．１ 菌种

Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ：本 实 验 室 保 存，斜 面４ ℃保 藏。

１．１．２ 主要材料与试剂

马铃薯、麸皮、豆粕：市售，购于本地农贸市场。 葡萄糖、ＮａＣｌ、磷 酸 二 氢 钾、磷 酸 氢 二 钾、三 羟 甲 基氨基甲烷、ＨＣｌ：均 为 分 析 纯，购自国药集团化学试 剂有限责任公司；琼脂：生化试剂，购自北京奥博星生 物技术有限责任公司；Ｌ－亮氨酸对硝基苯胺：分析纯， 购自Ｓｉｇｍａ公司。

１．２ 仪器与设备

ＬＲＨ－２５０－２型恒温培养箱上海博讯实业有限公司；ＨＶＥ－ＦＯ 型高压蒸汽灭菌锅 金坛市恒丰仪器 厂；ＳＷ－ＣＪ－２Ｆ型超 净 工 作 台 宁波新芝生物科技有 限公 司；ＰＬ４０３ 型 电 子 天 平 梅 特 勒－托 利 多 公 司； ３１１０型紫外－可见分光光度计 上海光谱仪器有限公 司；Ｂ－２６０型水浴锅 上海医疗器械五厂。

１．３ 方法

１．３．１ 主要试剂的配制方法

磷酸缓冲液的制备（ｐＨ７．５）：使用电子天平准确 称取磷酸 氢 二 钠 ６．０２ｇ 和 磷 酸 二 氢 钠 ０．５ｇ 加 入 １０００ｍＬ容量瓶中，然后加蒸馏水定容至１０００ｍＬ。

１．３．２ 培养基的配制

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（ＰＤＡ）的配制：将５００ｇ削 皮、干净的土豆切碎置于１０００ｍＬ 大 烧 杯 中，补 充 蒸 馏水 至１０００ｍＬ，电炉加热并维持煮沸状态２０ｍｉｎ， ４层纱布过滤，用蒸馏水将滤液补充至１０００ｍＬ，加入 葡萄糖和琼脂粉各２０ｇ煮沸直至全部溶解，分装于三 角瓶中，于１２１ ℃灭菌２０ｍｉｎ。 麸皮豆粕培养基的制备：准确称量豆粕２０ｇ、麸皮 ８０ｇ，添加１倍质量含不同盐浓度的水混 匀。混 匀 后 分装３０ｇ于２５０ｍＬ的三角瓶中，三角瓶中的盐浓度 梯度为０、１％、３％、５％、７％（ｇ／ｄＬ），于１２１ ℃高压蒸 汽灭菌２０ｍｉｎ，灭 菌 后 摇 瓶，保 持 原 料 处 于 疏 松 的状态。

１．３．３ 菌种的培养

１．３．３．１ 斜面培养

将冰箱中４℃冷冻保藏的米曲霉菌种以无菌操作 的方式接种于新制备的 ＰＤＡ 斜面培养基上，于３０ ℃ 恒温培养７２ｈ，备用。

１．３．３．２ 米曲霉的活化培养

将斜面上培养的成熟的米曲霉用接种环以无菌操 作方式接种于 ＰＤＡ 斜面培养基上，于３０ ℃恒温培养 箱中培养７２ｈ。

１．３．３．３ 制备孢子悬液

取生长良好的试管斜面菌种，用磷酸盐缓冲液轻 轻地将培养基上生长的米曲霉洗脱至装有玻璃珠的 １５０ｍＬ无菌三角瓶中，震荡２０ｍｉｎ 后用双层纱布过 滤，然后使用血球计数板计数并 调整孢子浓度为 １０７ 个／ｍＬ。

１．３．３．４ 米曲霉的制曲培养

取适 量 孢 子 悬 液 以 无 菌 操 作 方 式 按 照 ３％ （ｍＬ／１００ｇ）的接种量接种于麸皮豆粕固体培养基上， 于３７ ℃培养７２ｈ。

１．３．４ 氨肽酶粗酶液的制备

取５ｇ于３７℃培养后的固体干曲，按照１∶２０（ｇ／ｍＬ） 加入０．１ｍｏｌ／ＬｐＨ 值为７．５的磷酸盐缓冲液，于４０℃ 水浴中，间歇搅拌，浸提１ｈ，用４层纱布过滤后即可获 得氨肽酶粗酶液。

１．３．５ 氨肽酶酶活力的测定

氨肽酶活力的测定采用亮氨酸对硝基苯胺法，以亮 氨酸氨肽酶酶活计。在 试 管 中 加 入２ｍＬ０．１ｍｏｌ／Ｌ ｐＨ７．５的磷酸盐缓冲液，然后向缓冲液中加入１ｍＬ经 过稀释一定倍数的米曲霉氨肽酶粗酶液，最后向缓冲液 中加入１ｍＬ的 Ｌ－亮氨酸对硝基苯胺，轻轻摇晃试管使 其充分混合均匀，于５０℃水浴锅中反应１０ｍｉｎ，立即取 出冰浴并于４０５ｎｍ处测量吸光值。 计算公式：Ｘ＝１０５．７×４×Ｎ×Ｙ／１００００。 式中：Ｘ为氨肽 酶 粗 酶 液 的 酶 活 力；Ｎ 为４０５ｎｍ 处测定得到的吸光值；Ｙ 为粗酶液的稀释倍数。 氨肽酶酶活力的定义：将５０ ℃反应条件下，每分 钟催化 Ｌ－亮氨酸－对硝基苯胺产生１μｍｏｌ对硝基苯 胺所需的酶量定义为１个酶活力单位（Ｕ）。

２ 结果与分析

在３７ ℃下将米曲霉在含有不同 ＮａＣｌ浓 度 （０、 １％、３％、５％、７％，ｇ／１００ｇ）的麸皮豆粕固体培养基上 进行培养，米曲霉生长情况见表１。

由表１可知，培养基中添加 ＮａＣｌ对米曲霉的生长有 一定的影响。在麸皮豆粕固体培养基中 ＮａＣｌ浓度由０ 增加到３％的过程中，米曲霉的生长速度随着盐浓度增加 而提高。在 ＮａＣｌ浓度为３％时，米曲霉培养７２ｈ出现大 量绿色孢子；而 ＮａＣｌ浓度为０时，需培养８４ｈ才有大量 绿色孢子产生，由此推测培养基中 ＮａＣｌ浓度为３％时，对 米曲霉的生长及产酶能力有一定程度的增强。当 ＮａＣｌ 浓度超过３％时，米曲霉生长又会变得缓慢，即当 ＮａＣｌ浓 度大于３％时，随着盐浓度的不断升高，对米曲霉的生长 又表现出一定的抑制作用。

３ 结论

试验结果表明，ＮａＣｌ对 米 曲 霉 的 生 长、米 曲 霉 产 氨肽酶能力以及米曲霉产氨肽酶活力都有一定影响。 在含有３％ ＮａＣｌ的培养基上培养，对米曲霉产氨肽酶 的能力有一定的促进作用，但在超过５％ ＮａＣｌ的培养 基上培养，对米曲霉产氨肽酶能力有明显的抑制作用。 在磷酸盐缓冲溶液中 ＮａＣｌ浓度为０～１０％时，随着盐 浓度的不断 增 加，对氨肽酶活力有一定的促进作用， １０％时达到最高，培养７２ｈ酶活力为２６．２５８Ｕ／ｍＬ， 较未 添 加 ＮａＣｌ时酶活力提高了 ５．２９％，超 过 １０％ ＮａＣｌ浓度对氨肽酶活力有明显抑制作用。但 经 过 在 含 ＮａＣｌ培养基 上 进 行 驯 化 培 养 后，米 曲 霉 氨 肽 酶 的 耐盐性及活 力 都 得 到 一 定 的 提 升。３％ ＮａＣｌ浓 度 下 驯化培养后的米曲霉氨肽酶活力在１５％ ＮａＣｌ浓度环 境中最高，为２９．８８４Ｕ／ｍＬ，与未经 ＮａＣｌ驯化培养相 比较，米曲霉氨肽酶最大酶活力提高了１３．８１％，盐浓 度提高了５％。


 

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