球孢白僵菌 Beauveria bassiana 是一种可寄生在多种昆虫上具较强致病性的真菌， 已被广泛用作防 治森林、 农作物虫害的生物农药 ； 它产生大量如非核糖体多肽、 聚酮类等次生代谢产物， 可抑制多 种腐生或寄生线虫 。 聚酮、 非核糖体多肽及其杂合化合物如聚酮中的红霉素 、 四环素； 非核糖体 多肽中的青霉素、 头孢霉素 ； 聚酮和非核糖体多肽的杂合化合物如他克莫司、 雷帕霉素 、 博来霉 素 、 埃博霉素等具有免疫抑制剂或抗肿瘤等生理活性。

1 材料与方法

1.1 菌株和培养条件

昆虫致病真菌球孢白僵菌（菌株号： YH02）来源于云南云百草生物技术有限公司， 将 YH02 菌株接 种在 MY 固体培养基（malt/yeast extract medium）上， 置于 25 ℃恒温条件下培养， 每隔 2 周转接 1 次； 用 于基因组 DNA 和总 RNA 提取的真菌接种于液体 MY 培养基中， 置于 120 r·min－1 和 25 ℃条件下培养 5~7 d 后， 收获约 0.5 g 菌丝体， 用吸水纸彻底吸干后在液氮环境下用研钵研磨成粉末用于基因组 DNA 和 总 RNA 的提取。 MY 培养基的具体配方麦芽糖 6.0 g·L－1 ， 酵母提取物 4.0 g·L－1 ， 固体培养基配置时加 20.0 g·L－1 琼脂。

1.2 试剂与器材

试验涉及试剂包括： 真菌基因组 DNA 提取试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司）， 高保真聚合 酶、 真菌总 RNA 提取试剂盒（大连宝生物工程公司）， 反转录试剂盒（赛默飞世尔科技有限公司）， 无缝 克隆试剂盒（Biomiga）。 主要使用仪器为 NanoDropTM 2000 紫外分光光度计（赛默飞世尔科技有限公司）、 Azure C300 凝胶成像系统（Azure Biosystems）、 隔水式恒温培养箱（上海九州网址实业有限公司医疗设备厂）、 多功能组合摇床（江苏太仓实验设备厂）。

1.3 Bbpks2 基因的挖掘及克隆

首先以曲霉中已报道过的 PKS 基因为模板， 利用本地 BLAST（basic local alignment search tool）对球 孢白僵菌基因组进行扫描， 获得可能含有 PKS 基因的重叠群（contigs）， 然后利用 antiSMASH（//antismash.secondarymetabolites.org/）软件进行验证， 并利用 GENEFISH 对重叠群进行开放阅读框扫描， 通过 生物信息学分析获得白僵菌基因组中 Bbpks2 基因的 DNA 序列。 根据 DNA 序列设计 2 对特异引物（Bbpks25F： 5′-ATGTCTTCGCACCAAAACGA-3′； Bbpks2MR： 5′- AACAGCACTGTCACTGTCCAC-3′ ； Bbpks2MF： 5′ -AACGCTGGCTATAATGCTCTT-3′ ； Bbpks23R： 5′ - GGCTTCCTGGAGCGGTAA-3′）用于 Bbpks2 基因全长 cDNA 的克隆。 以球孢白僵菌的 cDNA 为模板， 用 HiFi 高保真酶分别扩增出 Bbpks2 基因的 5′片段和 3′片段， 经 DNA 纯化试剂盒将这 2 个片段纯化后， 按照无缝克隆试剂盒说明书中的具体步骤将 Bbpks2 基因的 5′片段和 3′片段连接起来， 获取全长 cDNA。 将该基因片段连接到克隆载体 Peasy-T3 上， 转化到 Trans-T1 感受态细胞中， 进行蓝白斑筛选后， 通过 菌落 PCR 筛选含有插入片段的阳性克隆送到上海生工进行测序。

1.4 聚类分析方法

从美国生物技术信息中心（NCBI）上选择功能已知且鉴定过化合物的 PKS/NRPS 蛋白序列， 包括黄曲 霉 Aspergillus flavus， 米曲霉 A. oryzae 中编码环匹阿尼酸（cyclopiazonic acid）生物合成的 CpaA 基因 （BAI43678， BAG82673）， 扩展青霉 Penicillium expansum 中编码球毛壳甲素（chetoglobosin A）生物合成 的 CheA 基因（CAO91861）， 棒曲霉 A. clavatus 中编码细胞松弛素 E（cytochalasin E）生物合成的 CcsA 基 因 XM_001270542， 异孢镰刀菌 Fusarium heterosporum 中编码伊快霉素（equisetin）的 EqiS 基因（Q5SBL2）， 水稻恶苗病菌 Fusarium fujikuroi， 串珠赤霉菌 Gibberella moniliformis 及假禾谷镰孢菌 Fusarium pseudograminearum 等 真菌 中 编 码镰 刀 菌素 C（fusarin C）生物 合成的 FusA（AFP73394） ， FusS （AAT28740） ， pks10（EKJ71911）等基因， 烟曲霉 Aspergillus fumigatus 中编码假散囊菌素 A（pseurotin A）的 PsoA 基因 （ABS87601）， 球孢白僵菌中编码卵孢白僵菌素（tenellin）的 TenS 基因（XP_008600657）等蛋白序列用于聚 类分析， 采用 MEGA 7.0 中的 Clustal W 程序对所选择的 PKS 蛋白序列和球孢白僵菌中的 BbPKS1 蛋白 序列进行比对后， 采用邻位相接法（neighbor-joining）， 自检举 1 000 次， 其余采用默认参数构建系统进 化树。 依据聚类结果， 从基因起源与功能分化的角度预测该基因功能， 并进一步推测该基因产生的聚酮 化合物。

1.5 Bbpks2 基因在不同培养基上的表达

根据分离得到的 Bbpks2 基因的 DNA 序列， 设计特异检测引物（TBbpks2F： TCTCCTTGGCAAGGTTACTG； TBbpks2R： ACCACGCTCCATCATGTACT）。 然后将球孢白僵菌培养在添加不同碳源、 氮源的培 养基上。 不同碳源实验的基础培养基为 6.0 g·L－1 麦芽浸粉， 3.0 g·L－1 酵母提取物， 分别添加 4.0 g·L－1 乳 糖、 甘露醇、 麦芽糖、 葡萄糖、 山梨醇、 果糖、 肌醇； 不同氮源实验的基础培养基为 1.8 g·L－1 麦芽糖， 6.0 g·L－1 葡萄糖， 分别添加 4.0 g·L－1 牛肉浸粉、 酪蛋白胨、 胰蛋白胨、 马铃薯。 培养 14 d 后， 从每种 培养基上收获 0.5 g 菌丝体， 采用真菌总 RNA 提取试剂盒按照说明书步骤提取各自的总RNA， 并选择浓 度合适的 RNA 采用反转录试剂盒将其反转录成 cDNA， 再用特异引物 TBbpks2F 和TBbpks2R 检测该基 因的表达情况。 在琼脂糖凝胶电泳检测过程中， 各 PCR 产物和 1 kb DNA marker 的点样量均为 2.5 μL， 电泳结束后， 利用 Azure C300 凝胶成像系统自带的图像分析软件分析各条带的积分光密度， 比较各 PCR 产物条 带的积分光密度值， 并以该值与 1 kb marker 的条带进行比较作为相对表达量绘制柱状图。

2 结果与分析

经无缝克隆获得 Bbpks2 基因的全长 cDNA。 分析显示： Bbpks2 基因全长 12 051 bp， 编码 4 016 个 氨基酸； 经过序列相似性及保守结构域的分析显示， 该基因编码蛋白的结构域组织顺序为 KS-AT-DHMT-KR-ACP-C-A-PP-SDR； 该蛋白同时含有 PKS 和 NRPS 酶蛋白的结构域， 由此推断该蛋白是一种 PKS/ NRPS 酶蛋白复合体。该聚类树可 分为 4 个较大的亚类（分支Ⅰ， Ⅱ， Ⅲ， Ⅳ）， 各个亚类间的结构域组织顺序存在差异， 至少存在 1 个结 构域的不同； 镰刀菌属 Fusarium 真菌中编码伊快霉素、 不同真菌中参与编码细胞松弛素 E 的酶蛋白聚 到同一分支上， 且二者亲缘关系明显较近。 球孢白僵菌的 BbPKS2 蛋白与这 2 类酶蛋白被归类到分支Ⅱ 中， 该亚类的结构域组织顺序为 KS-AT-DH-MT-KR-ACP-C-A-PP-SDR； BbPKS2 与球孢白僵菌 JEF007 菌 株（PMB64475.1）、 头状虫草 Tolypocladium capitatum（PNY25600.1）聚在一个亚分支中； 推测 BbPKS2 蛋 白所参与合成的天然次生代谢产物与伊快霉素、 细胞松弛素 E 存在一定的结构相似性。

3 讨论

球孢白僵菌主要是在机械压力和酶共同作用下侵染昆虫寄主 ， 在昆虫体内通过次生代谢途径中相 关酶类所产生的毒素致死寄主 。 但该真菌次生代谢途径中所产生的毒素除少数外， 尚有大量的次生代 谢产物生物合成基因未与相关化合物关联。 结合基因组挖掘技术和一菌多产物策略（one strain many compounds， OSMAC）、 异源表达等操作技术可促进该问题的解决， 从真菌基因组数据中可大量挖掘得 到 PKS， NRPS 等生物合成基因， 通过序列相似性、 结构域、 基因片段的大小及聚类分析等初步推断该 基因的功能， 初步了解该酶所参与合成化合物的某些结构 。 如编码 2-吡啶酮卵孢白僵菌素（2-pyridone tenellin）酶蛋白的 PKS/NRPS 基因约 12.9 kb ， 编码镰刀菌素 C 酶蛋白的 fusA 基因（PKS/NRPS）约 11.9 kb ； BALI 等 在大肠埃希菌 Escherichia coli 中过量表达其 SDR 等末端释放结构域， 发现该结构 域对结构中含有环己酮的底物具较高活性。 同时因本研究中的 Bbpks2 基因尚未发现有较高同源性基因 存在， 通过结构域分析推测该基因所编码的酶蛋白属于 PKS/NRPS， 参与聚酮/非核糖体多肽的生物合 成， 且该化合物与伊快霉素、 细胞松弛素 E 存在某些共同的结构； 通过比较分析伊快霉素、 细胞松弛素 E， 综合分析该化合物可能含吡咯烷酮结构。



 

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