土霉素( OTC) 是一种四环素类抗生素，能有效抑制致病微生物感染以及细菌生长繁殖，因其抗菌 性好、成本低，在医疗卫生、农业、畜牧业和水产养殖业中得到了广泛应用。但长期使用抗生素会造 成其残留量增多和在环境中的累积，增强细菌、病毒的耐药性，易引发公共安全等问题。因此， 发展简单、快速、灵敏、低成本的抗生素检测方法对环境监测、疾病预防具有重要意义。

1 实验部分

1. 1 材料与仪器

石墨粉( 青岛富润达石墨有限公司) ; 土霉素( OTC) 、金霉素、四环素( 纯度大于 98%，上海泰坦科技股 份有限公司) ; 钛酸正丁酯( 分析纯) 、90%( 脱乙酰基) 壳聚糖( Chitosan，CHIT) 、25%戊二醛( GA) 购自国药 集团化学试剂有限公司; 三羟甲基氨基甲烷( 纯度大于 99%) 、牛血清白蛋白( 纯度大于 96%，BSA) 购自上 海麦克林生化科技有限公司; 氨基标记的 OTC 适配体序列( 5-NH2-( CH2 ) 6-GGA ATT CGC TAG CAG GTT GAC GTT GAC GCT GGTGCC CGG TTG TGG TGC GAG TGT TGT GTG GAT CCG AGC TCC ACG TG-3) 由生工生 物工程( 上海) 股份有限公司合成。其它试剂均为市售分析纯，实验用水为18. 2 MΩ·cm 的超纯水。 CHI600D 电化学工作站( 北京华科普天科技责任有限公司) ; KQ5200V 超声波清洗仪( 昆山市超声 仪器有限公司) ; TGL － 20M 台式高速冷冻离心机( 上海卢湘仪离心机仪器有限公司) ; 九州网址GZX-9030MBE 电热鼓风干燥箱( 上海九州网址实业公司医疗设备厂) ; DF － 101S 集热式恒温磁力搅拌器( 上海梅香仪器有 限公司) ; SU8010 日立高分辨场发射扫描电镜( 日本株式会社公司) ; Nexus470 傅里叶变换红外光谱仪 ( Nicolet 公司) ; HSX － F /UV300 氙灯光源( 北京纽比特科技有限公司) 。

1. 2 标准溶液的配制

1. 2. 1 土霉素溶液

称取适量 OTC 用 PBS 缓冲液( 0. 1 mol /L KH2PO4 － 0. 1 mol /L Na2HPO4 ) 溶解定 容，配成 0. 01 mol /L OTC 溶液作为母液，于 － 20 ℃ 避光保存。所需不同浓度的 OTC 以此逐级稀释， 于 4 ℃冰箱保存。

1. 2. 2 土霉素适配体( OTC － aptamer) 溶液

将所购 OTC － aptamer( 100 mmol /L NaCl，20 mmol /L Tris － HCl，5 mmol /L KCl，1 mmol /L CaCl2，2 mmol /L MgCl2 ) 的链序列 1 OD，在 12 000 r/m 下离心， 加入适当体积缓冲液配成 100 μmol /L 的贮存液，于 － 20 ℃冰箱保存。用 Tris － HCl 缓冲液将贮存液稀 释至 1. 5 μmol /L，于 4 ℃冰箱保存。使用前，在 95 ℃加热 5 min 后进行淬火，自然冷却至室温。

1. 3 传感界面的构建

1. 3. 1 氧化石墨的制备

采用常规的 Hummers 法制备氧化石墨: 在适量浓 H2 SO4、NaNO3 和石墨 粉存在下，缓慢加入 KMnO4，搅拌反应一段时间后，加入一定量的 30% H2O2 除去未反应的 KMnO4， 离心得到沉淀物，用 5% 稀盐酸洗涤、离心多次，至滤液中不能检出 SO2 － 4 ，将沉淀物放入透析袋中， 在水中透析至 pH 值接近中性。将产物放入 60 ℃烘箱中干燥，得到氧化石墨。

1. 3. 2 FTO 导电玻璃的清洗

将 FTO 导电玻璃依次在丙酮、无水乙醇和水中各超声清洗 15 min 后， 在烘箱中烘干。

1. 3. 3 TiO2 /FTO 导电玻璃电极的制备( TiO2 /FTO)

先用水热法制备纳米 TiO2，即在 100 mL 烧杯 中加入 30 mL 水，再加入 30 mL 浓盐酸，搅拌条件下缓慢加入 1 mL 钛酸正丁酯，搅拌 30 min 后得到 混合液。量取适量混合液倒入反应釜中，将烘干的 FTO 导电面朝下插入有混合液的反应釜中，盖紧， 放入160 ℃干燥箱中，反应6 h。样品自然冷却后，用水清洗玻璃，再放入450 ℃马弗炉中恒温3 h 后， 即得到 TiO2 /FTO 导电玻璃电极。

1. 3. 4 TiO2 － 石墨烯/FTO 纳米复合电极( TiO2 － rGO/FTO) 的制备

将 100 mg 氧化石墨分散于 300 mL 水中，超声分散 2 h，得到氧化石墨烯( GO) ，并以此作为工作液; 用玻璃刀将 TiO2 /FTO 导电玻璃 切成 1 cm × 1 cm，以其作为工作电极，铂丝为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，采用循环伏安法( 扫描范围为 － 2. 5 ～ 2. 5 V，扫描速率为 50 mV·s － 1 ) 进行电化学还原，经适当时间后，取出工作电极， 用水冲洗并吹干，即得到 TiO2 － rGO/FTO 纳米复合电极。

1. 3. 5 土霉素适配体的固定化修饰

在 TiO2 － rGO/FTO 纳米复合材料电极表面滴涂 90 μL 壳聚糖溶 液，在空气中干燥过夜成膜，用水清洗吹干后，将 50 μL 稀释的戊二醛溶液( 2. 5% ) 滴涂至修饰电极表 面，室温下放置 1 h。清洗并干燥后，滴涂50 μL 1 μmol /L 的 OTC 适配体，在4 ℃冰箱中放置12 h 后， 用 PBS 缓冲液洗去未反应的 OTC 适配体，滴加 50 μL BSA 在 37 ℃反应 1 h，封闭残留位点，经 PBS 缓 冲液冲洗后，即得到土霉素适配体修饰的 TiO2 /石墨烯复合材料电极( Aptamer/TiO2 － rGO/FTO) 。

1. 4 OTC 的检测

将制备好的传感界面( Aptamer/TiO2 － rGO/FTO) 与 50 μL 不同浓度 OTC 溶液( 0. 1 mol /L PBS，pH 7. 4) 在 60 ℃下反应 1 h 后，用水清洗。采用 150 W 氙灯作为激发光源，在 CHI600D 电化学工作站( 三 电极体系，其中修饰电极为工作电极，铂丝为对电极，饱和甘汞电极为参比电极) 上，选用安培电流时 间曲线法( 初始电位 － 0. 1 V，运行时间 100 s) 记录 OTC 反应前后的光电流值，以光电流的变化值作为 与目标物浓度对应的信号值。

2 结果与讨论

光电化学适体传感器检测土霉素的实验原理如图 1 所示。实验采用 FTO 导电玻璃为基底，在其表 面制备了 TiO2 /石墨烯复合材料，通过滴涂壳聚糖溶液，使电极表面带上氨基，通过戊二醛交联，使氨 基标记的土霉素适配体牢固地修饰至电极表面。采用电化学工作站检测修饰了土霉素适配体的光电流， 此时得到的光电流为 I0。将修饰电极用于某一浓度的土霉素溶液测定时，土霉素与其适配体发生特异 性结合形成复合物，测得光电流值为 I。由于目标物与适配体的特异性结合，阻碍了光电传感界面对光 的有效吸收及光生电子的转移，从而导致光电流减小，其信号值用 ΔI 表示，ΔI = I0 － I。基于电流的变 化值与待测物土霉素的浓度成正比，从而实现土霉素的测定。


3 结 论

在 FTO 先后用水热法及电化学方法制备了纳米 TiO2 /石墨烯光电传感基底，比较了单一材 料及复合体系的光电化学性能。结合土霉素适配体对土霉素检测的专一性与光电化学法的快速、经济、 简单、灵敏的优点，成功构建了一种性能优良、稳定性可靠、成本低、选择性好的测定土霉素的光电 化学传感器，实现了对水样中微量土霉素的检测。在优化条件下，该传感器的线性范围为 5. 0 × 10 － 9 ～ 5. 0 × 10 － 6 nmol /L，检出限为 1. 0 × 10 － 9 mol /L，有望用于实际样品中微量土霉素残留的测定。



 

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