骨肉瘤是起源于间叶组织的恶性肿瘤，患病人 群多集中在儿童、青少年、55 岁以上的中老年人。 骨肉瘤易发生在血运丰富的长管状骨干骺端，早期 极有可能发生肺转移，且发展迅速。目前的主要 治疗方式为手术切除和化疗相结合，但由于复发 和耐药发生率较高，严重影响了术后预后。紫草 素属于萘醌类物质，是紫草中主要活性成分，又称紫草醌或紫草宁，因具有抗癌、抗炎、抗菌、抗氧 化、神经保护、心脏保护、伤口愈合等作用而被广 泛报道，常用于治疗结肠癌、肝癌、神经胶质瘤、 关节炎、哮喘、急性肺损伤等。但紫草素对人骨肉 瘤的抑制活性报道较少。本研究探索紫草素通过调 控内质网应激蛋白诱导人骨肉瘤细胞死亡的作用 及其机制。

1 材料

1.1 仪器

BSA124S 分析天平（德国 Sartoruis 公司）； BSC-1000ⅡA2 生物安全柜（上海九州网址实业有限公司）；HEPA Class100 型二氧化碳培养箱、Easy pure Ⅱ超纯水仪、BiofugePrimorcentigge 型高速冷冻离 心机（美国 Thermo Fisher Scientific 公司）；CKX41 倒置显微镜（日本 Olympus 公司）；Accuri C6 流式 细胞仪（美国 BD 公司）；SpectraMax Plus 384 酶标 仪（美国Molecular Devices公司）；Mini-Protean Tetra 电泳槽、Mini Trans-Blot 转印槽、ChemiDOC XRS+ 分子成像系统（美国 Bio-Rad 公司）；上海九州网址YXQ-50S11立式压力蒸汽灭菌锅（上海九州网址实业有限公司）； 化学发光仪（美国 Turner Designs 公司）。 

1.2 试剂

紫草素（批号 S827904）购自美国 Selleck Chemicals 公司，质量分数 99.03%；胎牛血清（FBS） （批号 1816937）、Lipofectamine 2000 转染试剂购自 美国 Thermo Fisher Scientific 公司；RPMI-1640 培 养基（批号 AAF023615）购自美国 GE 生命科学； 细胞计数试剂盒（CCK-8）（批号 40203ES60）、细 胞凋亡试剂盒（批号 40302ES20）购自上海翊圣生物科技有限公司；人 ATF4（ab184909）、ATF6 （ab62576）、GRP78（ab108615）、IRE1α（ab124945）、 GAPDH（ab181602）单克隆一抗、辣根过氧化物酶 标记的羊抗兔 IgG 二抗（ab6721）均购自美国 abcam 公司；干扰 RNA 订购于锐博生物科技有限公司； 质粒订购于通用吉满生物科技有限公司；海肾荧光素酶报告质粒（E2231）、双荧光素酶报告基因检测试剂盒（E2920）购自美国 Promega 公司。

1.3 细胞

人骨肉瘤 U-2 OS 细胞购自中国科学院细胞库。

2 方法

2.1 细胞培养

从液氮罐中取出冻存的人骨肉瘤 U-2 OS 细 胞，将冻存管立即放入 37 ℃水浴中，轻摇使其迅 速融化，解冻后的细胞置于离心机中 1 000 r/min 离 心 5 min，吸弃冻存液，加入 1 mL 温热的 RPMI-1640 完全培养基轻轻吹打，转入培养瓶中，缓慢补加适 量完全培养基，轻轻摇动培养瓶形成单细胞悬液， 放入培养箱中（37 ℃、5% CO2 浓度、饱和湿度） 培养。待培养基颜色发生明显变化后使用移液器吸 弃培养基，温热 PBS 润洗 2 次后加入等体积新鲜培 养基，于相同条件下继续培养，直至达到实验所需 细胞汇合度。取汇合度为 80%～90%的生长状态良 好的细胞，吸弃旧的培养基，加入 2 mL 温热 PBS 轻轻润洗 2 次，然后加入 2 mL 温热的 0.25%胰蛋 白酶消化细胞，置于培养箱中孵育 2 min，取出放 置于显微镜下进行观察，待细胞形态由贴壁状态下 的梭形逐渐收缩变圆、间隙增大后吸弃消化液终止 消化，加入适量温热的新鲜完全培养基，接着用移 液器轻轻吹打贴壁细胞，使之脱落并处于单细胞悬 浮状态，计数后取适量细胞分置于新的无菌培养瓶 内继续培养或用于实验。

2.2 CCK-8 法检测细胞增殖抑制率

取处于对数生长期且状态良好的 U-2 OS 细胞， 0.25%胰蛋白酶消化使贴壁细胞脱落，新鲜完全培104 /mL 的单细胞悬液，以 200 μL/孔的体积接种于 96 孔培养板中，置于 5% CO2 培养箱中 37 ℃孵育 过夜；弃旧培养基，加入等体积一系列浓度梯度 （0.156 25、0.3125、0.625、0.125、0.25、0.5、1、2、 4 μmol/L）紫草素培养基稀释液，继续培养 48 h 后， 于每孔加入 20 μL CCK-8 溶液，放入培养箱中继续 孵育 4 h，酶标仪在波长为 490 nm 测定每个孔的吸 光度（A）值，计算不同浓度的紫草素对细胞的抑 制率。实验重复 3 次，用 Graphpad Prism 5.0 软件 计算紫草素对受试细胞株的 IC50 值。 抑制率＝（1－加药孔平均 A 值）/空白对照孔平均 A 值

2.3 紫草素对 U-2 OS 细胞凋亡的影响

取对数生长期的人骨肉瘤 U-2 OS 细胞，弃去 培养基，PBS 清洗 2 次，胰蛋白酶消化后，用新鲜 培养基收集细胞，计数，以 1×105 /mL 细胞密度接 种于 6 孔培养板中，每孔 2 mL，放入培养箱培养。 过夜待细胞贴壁，分别加入 0、1、2、4 μmol/L 紫 草素处理，继续孵育 24 h 后，收集各孔细胞上清液， 并使用胰蛋白酶消化细胞，收集细胞置离心管中与 上清液合并，2 000 r/min 离心 5 min，弃上清，重 复一次。往离心管中加入预先配好的 100 μL 1× Annexin V Binding Solution，制成细胞悬液，并依 次加入 Annexin V-FITC 结合物和 Propidium Iodide （PI） Solution 各 5 μL，轻弹离心管混匀试剂，室 温下避光培养 15 min。最后加入 400 μL 1×Annexin V Binding Solution，使用流式细胞仪进行检测。

2.4 紫草素对内质网应激蛋白的调控检测

取对数生长期的人骨肉瘤 U-2 OS 细胞，常规消化 后，用新鲜培养基收集细胞，计数，细胞以 5×105 /孔 接种于 6 孔培养板中，放入培养箱培养。过夜待细 胞贴壁，分别加入紫草素 0、0.5、1.0、2.0 μmol/L， 继续孵育 24 h 后，收集细胞，加入预配制的含 PMSF 和蛋白酶抑制剂混合物的 Western、IP 细胞裂解液， 制备蛋白样品，BCA 法测定蛋白浓度。制备 10% 的分离胶和 4%浓缩胶对蛋白样品进行电泳分离， 转 PVDF 膜，脱脂牛奶封闭 2 h，加入相应的一抗 （1∶1 000）4 ℃孵育过夜，HRP 标记的二抗（1∶ 10 000）常温孵育 2 h，加入増强型化学发光液上机， 对内质网应激蛋白的表达进行检测。

2.5 内质网应激基因敲低和过表达对细胞活力的影响

对数生长期的人骨肉瘤 U-2 OS 细胞调整浓度 为 2.5×105 /mL 后接种于 6 孔培养板中，于培养箱中孵育过夜，75 pmol siRNA 寡核苷酸或 4、8 μg DNA 质粒与 Lipofectamine 2000 试剂混合后转染细 胞，6 h 换液，加入 0.4、0.8、1.6 μmol/L 紫草素继 续孵育 48 h，使用 CCK-8 试剂盒检测细胞活力。

2.6 报告基因检测

将 ATF4 或空白质粒（3 μg）、GRP78 报告质粒 （3 μg）和海肾内参质粒（4 μg）均匀混合，用 Lipofectamine 2000 试剂对人骨肉瘤 U-2 OS 细胞进 行转染，6 h 换液，加入 0.8 μmol/L 紫草素继续孵 育 24 h，使用温热的 PBS 清洗 2 次，按说明书先检 测萤火虫荧光，再检测海肾荧光，实验结果用各孔 海肾荧光做参比进行校正。

2.7 统计学方法

采用 Graphpad Prism 5.0 统计软件进行数据处 理，计量资料采用x±s 来表示，统计方法采用独 立样本 t 检验或单因素方差分析。

3 结果

流式细胞术检测发现，紫草素 0～4 μmol/L 作 用 24 h 能浓度相关性地诱导 U-2 OS 细胞凋亡，凋 亡细胞比例分别为 6.30%±0.29%、11.60%±3.21%、 42.70%±8.63%、71.29%±10.75%（与 0 μmol/L 剂 量组比较）。细胞活力实验检测显示，紫草素能浓度相关性 抑制 U-2 OS 细胞活力，与对照组相比有统计学意 义（P＜0.01）。与转染空白质粒相比，转染 ATF4 表达质粒可直接促进 U-2 OS 细胞死亡，随着 ATF4 转染剂量的增加，细胞活力进一步下降，结果有统 计学意义（P＜0.01）。将 GRP78 启动子序列后连接萤火虫荧光素酶 基因，构建 GRP78 报告质粒，海肾荧光素酶作为参比进行报告基因检测。结果显示，单独转染 ATF4 质粒可促进 GRP78 基因的转录，紫草素可增强内 源性或外源性 ATF4 对 GRP78 基因的转录促进效 果。与第一组转染了空白质粒的对照组相比，差异 有统计学意义（P＜0.01）。

4 讨论

青春期是骨肉瘤的发病高峰期，男性发病率高于女性，早期易发生转移。现阶段骨肉瘤的治疗模式是：术前新辅助化疗–手术切除–术后辅助化疗。化疗常用药物有阿霉素、甲氨蝶呤、顺铂和异环磷酰胺，通过不同组合联合用药。对于肿瘤 的手术切除，目前更倾向于广泛切除而非全间室切 除，并保留重要组织，以最大程度维持肢体功能。 该模式在有效降低骨肉瘤的转移和复发同时还能 有效提高患者的生活质量。除了易发生肺转移外， 骨肉瘤的治疗过程还常被突如其来的化疗耐药性阻断，因此远期生存率低于 30%。为了改善骨肉 瘤患者预后和生存率，人们从多方面寻找解决办法，开发新的治疗策略，包括根据基因测序结果个体化用药、放射治疗、免疫疗法和研究新的化疗药 物或耐药逆转剂等。

 

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