急 性 淋 巴 细 胞 白 血 病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）是一种恶性血液系统肿瘤疾病， 也是儿童时期最常见的恶性肿瘤，占儿童恶性肿 瘤的 35%。ALL 的临床症状主要表现为贫血、肝 脾肿大及免疫能力低下，对患者健康危害严重 。 ALL 的发病机理较为复杂，对其机理目前尚未完 全明确。

材料和方法

试剂及仪器

TRIzol 试剂购自美国 Invitrogen 公司；胎牛血清购 自美国 Hyclone 公司；ECL 试剂盒购自武汉艾美 捷科技有限公司；增殖细胞核抗原（PCNA）、 Caspase 3、Cyclin D1 及 MMP-9抗体均购自美国 Cell Signaling 公司；PVDF 膜购自美国密理博公司； 双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自北京索莱宝 科技有限公司；BCA 蛋白浓度测定试剂盒购自上 海威奥生物科技有限公司；FACSCanto 流式细胞仪 购自美国 BD 公司；DYCZ-24A 型双垂直电泳仪购自北京六一仪器厂；PCR 系统购自瑞士 Roche 公 司；超净工作台购自上海九州网址医疗生物仪器股份有限公司；CO2 细胞培养箱购自上海精密仪器仪表 有限公司。

临床标本采集

2018 年 5 月至 2018 年 11 月在本院确诊的 ALL 患 儿 23 例，其中男 14 例，女 9 例，年龄 8.9 ±2.3 岁， 参照张之南主编《血液病诊断及疗效标准》进行 诊断。患儿家属均签署知情同意书，且本研究经 医院伦理委员会批准。患儿的骨髓样本均在治疗 前采集，以防止药物对骨髓样本的干扰。采集患 儿骨髓样本 2 m1 后，置于含 K2EDTA 的抗凝管中， 加入 Ficoll 分离液进行密度梯度离心，以提取骨髓 单个核细胞（BMNC），置于液氮保存。 细胞培养及转染 采用含 10% 胎牛血清、5 μg/ml 青链霉素的 RPMI 1640 培养液，置于 37 ℃、5% CO2 的保温箱培养， 每 2-3 d 传代 1 次。

细胞转染步骤

将 BMNC 接种 至 24 孔 板， 分 为 对 照 组（Control 组），miR-221 阴 性 对 照 组（miR-221-NC 组）及 miR-221 转 染 组（miR-221 组），待细胞培养至对数期，按照 Lipofectamine 2000 试剂盒说明书进行转染操作， 并于 37 ℃、5% CO2 条件下培养。 ALL 细胞 miR-221 水平的 RT-PCR 检测 各组细胞转染后培养 24 h，采用 TRIzol 试剂盒提 取细胞总 RNA，检测 RNA 纯度后，通过逆转录试 剂盒合成 cDNA。按照 miRNA 荧光定量 PCR 试剂盒说明书检测 miR-543 水平，以 U6 为内参，miR221 上 游 引 物：5′-CTGACTGCGTCACTGC-3′； 下 游 引 物：5′-CTGACGTGCAGTGCAC-3′。U6上游 引物：5′-GCGTACTGCGTGCATC-3′；下游引物： 5′-GACACTGCAGTCACTC-3′。PCR 反应步骤为： 95 ℃ 2 min；然后 95 ℃ 30 s，62 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s， 共 32 个循环，采用 2- △△ Ct 法计算基因的相对水平。 miR-221 对 ALL 细胞活力影响的 MTT 法检测 将对数期细胞接种于 96 孔板，每孔 150 μl，细胞 密度为 3×105 /ml，每组均设置 3 个复孔，按照要 求转染后培养 1、2、3、4 和 5 d，然后每孔加入 15 μl 的 MTT 试剂， 37 ℃条件下培养 2 h，弃培 养液后每孔加入 100 μl 的 DMSO，采用酶标仪在 490 nm 处检测各孔 OD 值。 miR-221 对 ALL 细胞的细胞周期影响的流式细胞 术检测 各组细胞转染后培养 24 h，用 PBS 清洗 3 次后，经 70% 预冷的乙醇固定 12 h 后，制成密度为 1×105 /ml 的细胞悬液，加入 150 μl PI 染液避光孵育 30 min， 采用流式细胞仪检测细胞周期分布。 miR-221 对 ALL 细胞凋亡影响的流式细胞术检测 将对数期细胞接种在 6 孔板，按要求转染后培养 24 h，经 1×binding buffer 清洗 3 次后，制成密度 为 1×105 /ml的细胞悬液，加入 5 μl Annexin V-FITC 避光孵育 10 min，清洗后用 500 μl 的 1×binding buffer 重悬细胞，加入 5 μl 的 PI 孵育 20 min 后上 机进行细胞凋亡检测 ALL 细胞侵袭、迁移能力的 Transwell 检测 首先在 Transwell 上室均匀铺 100 μl 的 Matrigel 胶 （细胞迁移实验无此步骤），然后将各组细胞接 种于 Transwell 上室，每孔加入 100 μl，细胞数为 1×105 /ml，下室加入 500 μl 10％胎牛血清的培养 液中培养 24 h，取出小室后用棉签拭去小室上层 膜上未穿模的细胞，经 4% 的多聚甲醛固定 4 h 后， 采用 0.5% 结晶紫染色，经 PBS 洗涤 3 次后，在电 子显微镜下随机选择 5 个视野拍照并计数。蛋白表达水平的 Western blot 检测 收集各组细胞后经 RIPA 裂解液处理提取总蛋白， 经 BCA 法检测蛋白浓度。每孔上样 15 μg 蛋白， 经 10% SDS-PAGE 电泳分离后，采用湿转法将分 离的蛋白转至 PVDF 膜，并采用 5% 脱脂奶粉室 温下封闭 2 h，加入经稀释的 PCNA、Caspase 3、Cyclin D1 及 MMP-9 蛋 白 一 抗，4 ℃ 孵 育 过 夜， TBST 清洗 3 次后，加入 HRP 标记的二抗室温孵育 2 h，使用 TBST 清洗 3 次后，经 ECL 试剂发光显影， 拍照后采用 Quantity One 软件分析条带灰度值。 miR-221 靶向 Wnt 基因的荧光素酶报告基因实验 检测 利用 TargetScan 生物信息分析软件预测 miR-221 与 Wnt 基因的结合片段，通过 PCR 技术将该片段扩 增后插入荧光素酶载体构建 Wnt 基因野生载体， 同时通过基因突变技术将该结合片段的部分核苷 酸随机突变，用于构建 Wnt 基因突变载体。采用 脂质体转染法将 miR-221 mimic 和 Wnt 基因野生载 体或 Wnt 基因突变载体共转染 BMNC 细胞，每组 设置 3 复孔，置于 37 ℃、5% CO2 条件下培养 24 h， 按照双荧光素酶报告基因试剂盒说明书检测荧光 素酶活性。 统计学分析 采用 SPSS 21.0 软件处理数据，数据以均数 ± 标 准差表示，采用 t 检验分析数据，P＜ 0.05 示差异 有统计学意义。

结 果

转染后各组 ALL细胞的 miR-221水平 miR-221 组的 miR-221 的表达水平显著高于对照组 及 miR-221-NC 组（P＜ 0.05）（图 1）。


讨 论

ALL 是儿童时期较为常见的血液疾病，临床症状 主要表现为免疫功能减弱、贫血、发热及血小板 数量下降等 。在 ALL 治疗过程中，由于需要长期的化疗干预，往往会产生不良反应，对患儿健 康及生活也产生严重危害，有临床研究发现，儿 童急性淋巴细胞白血病治愈率较低，且容易复发， 严重影响治疗效果。有文献报道，乳腺癌患者的肿瘤组织中 miR-221 水平显著下降，这与患者预 后密切相关。miR-221 在肺癌、肝癌等多种癌细 胞中表达水平显著下降，通过上调细胞中 miR-221 水平，可抑制癌细胞增殖及迁移。因此，需 进一步分析 miR-221 对 ALL 细胞抑制效果，以期 为提高患儿治疗效果提供实验参考。