动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是一种多因 素复杂的炎症性疾病,是引起心血管类疾病的主要 原因。动脉粥样硬化早期发生发展的两个关键因 素是循环单核细胞跨内皮迁移进入血管壁及巨噬细 胞衍生泡沫细胞的形成。因此,抑制单核细胞迁 移、减少血管壁内巨噬细胞的形成对于抑制动脉粥 样硬化的发生意义重大。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂
人单核细胞株 THP-1 细胞,由上海生物科学研究所细胞资源中心提供,并在实验室进行传 代保株;体内实验所用 ApoE-/-小鼠由上海 SLAC 实 验室提供,许可证号:SCXK(上海)2017-0005;姜 黄素(生产批号:118-39-5,纯度≥98%),西安天丰 生物科技有限公司;胎牛血清、100 U·mL-1青霉素、 100 U·mL-1链霉素溶液,美国 Hyclone 公司;肉豆蔻 酸佛波酯(PMA),德国达姆施塔特,Calbichem; LPS,美国 Sigma 公司;TRIzol 试剂,美国 Invitrogen 公司;LS,北京艾德莱生物科技有限公司;高迁移 率族蛋白 B1(HMGB1)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1) ELISA 试剂盒,南京建成生物工程研究所;二异氰酸 酯试剂盒,美国 Thermo Science 公司;聚偏二氟乙烯膜 (Milli 孔隙),美国 Bedford 公司;脂质体 TMRNAiMAX 转 染 试 剂 , 美 国 InvitrogenLife Technologies 公 司 ; RT-PCR 试剂盒、WB 试剂盒,赛默飞世尔科技(中 国)有限公司;逆转录试剂盒,美国 Thermo Fisher Science 公司;其他试剂均为化学分析纯。
1.1.2 仪器
细胞计数器,美国 Nexcelom Bioscience LLC 公司;TriStar 2 LB 942 型多功能酶标仪,德国伯托公司;倒置显微镜,日本 Olympus 公司;紫外 可见分光光度计,北京莱伯泰科仪器有限责任公司;AR2130 型电子分析天平,上海梅特勒-托利多 有限公司;超低温冰箱,美国 Thermo 公司;BXM50VD 型高压灭菌锅,上海九州网址医疗生物仪器股份有 限公司;流式细胞仪,美国 Beckman Coulter 公司; J-2 000 型高速分散匀质器,常州丹瑞实验仪器设备 有限公司;F3 型全自动荧光与可见光凝胶成像分析 系统,英国 Syngene 公司;Western Blot 蛋白显影 仪,美国 Protein Simple 公司;低温高速离心机,盐 城凯特实验仪器公司;生物组织自动包埋机,湖北 康龙电子科技有限责任公司;7500 型 RT-PCR 仪, 德国 Leica 公司。
2 结果
与空白对照组相比,LPS 组细胞迁移数量显著增 加(P<0.01);与 LPS 组相比,姜黄素-20 组细胞迁 移数量显著降低(P<0.05);姜黄素-40、姜黄素-80 组细胞迁移数量显著降低(P<0.01)。提示在一定的 浓度范围内,THP-1 细胞迁移量与姜黄素的给药剂 量呈剂量依赖性降低趋势。与空白对照组相比,LPS 组 细胞 HMGB1、MCP-1 蛋白表达水平均显著升高(P< 0.01);与 LPS 组相比,姜黄素-20 组细胞 HMGB1、 MCP-1 蛋白表达水平均显著降低(P<0.05);姜黄 素-40、姜黄素-80 组细胞 HMGB1、MCP-1 蛋白表 达水平均显著降低(P<0.01)。提示 THP- 1 细胞HMGB1、MCP-1 蛋白表达与姜黄素的给药剂量存在 一定负相关,即呈剂量依赖性降低趋势。与空白对照组相比,LPS 组细胞 HMGB1、MCP-1 mRNA 表达水平均显著升高 (P<0.01);与 LPS 组相比,姜黄素-10 组 MCP-1 mRNA 表达水平显著降低(P<0.05);姜黄素-20 组 细胞 HMGB1 mRNA 表达水平显著降低(P<0.05), MCP-1 mRNA 表达水平显著降低(P<0.01);姜黄 素 - 40 组 、 姜 黄 素 - 80 组 细 胞 HMGB1、 MCP- 1 mRNA 表达水平均显著降低(P<0.01)。说明 THP-1 细胞 HMGB1、MCP-1 mRNA 表达水平与姜黄素的给 药剂量存在一定负相关关系,即呈剂量依赖性降低 趋势。与空白对照组相比,LPS 组细胞 AMPK、PPARα 蛋白表达水平均显著降 低,差异有统计学意义(P < 0.01),STAT3 蛋白表达 水平显著升高,差异有统计学意义(P < 0.01);与 LPS 组相比,姜黄素-10 组细胞 AMPK 蛋白表达水平 差异无统计学意义(P > 0.05),PPARα 蛋白表达水 平显著升高,差异有统计学意义(P < 0.05),STAT3 蛋白表达水平显著降低,差异有统计学意义(P < 0.05);姜黄素-20 组细胞 AMPK 蛋白表达水平差异 无统计学意义(P > 0.05),PPARα 蛋白表达水平显著 升高,差异具统计学意义(P < 0.05),STAT3 蛋白表 达水平显著降低,差异具有统计学意义(P < 0.05); 姜黄素-40、姜黄素-80 组细胞 AMPK、PPARα 蛋白 表达水平均显著升高,差异有统计学意义(P < 0.01),STAT3 蛋白表达水平显著降低,差异有统计学意义(P < 0.01);说明 THP-1 细胞 AMPK、PPARα 蛋白表达水平与姜黄素的给药剂量存在一定正相 关,即呈剂量依赖性升高趋势,而 STAT3 蛋白表达 水平与姜黄素的给药剂量存在一定负相关,即呈剂 量依赖性降低趋势。