柠檬酸（citric acid）又名枸橼酸，学名 2-羟基丙 烷-1，2，3-三羧酸，白色晶体，含一分子结晶水，无臭， 具有令人愉快的强烈的酸味，入口爽快，无后酸味，安 全无毒，被广泛用作食品和饮料的酸味剂。自 1945 年美国 Miles 公司借鉴深层发酵青霉素工厂，采用无 菌空气供给系统和机械搅拌通风发酵罐的成功经验 基础上，首先成功开发了深层发酵法工业化生产柠檬 酸。柠檬酸已成为全球产量和需求量最大的有机酸 品种。世界柠檬酸工业的集约化程度非常高，除中国 外，全球主要的柠檬酸制造商只有 5 家～6 家（美国、 奥地利、加拿大、巴西等），而中国的产量为最大，2017 年，全球柠檬酸及其盐产量达到 212 万吨，我国产量达 到 152 万吨，占全球近 70 %，是柠檬酸主要生产国和 出口国。

黑曲霉（Aspergillus niger）zs-10：江苏国信协联能 源有限公司天津分公司保藏。

无水葡萄糖、酵母粉、琼脂粉、大豆蛋白胨：分析纯， 天津市北方天医试剂公司；（NH）4 2SO4、KH2PO4、MgSO4、 CaCl2、KCl、FeSO4：分析纯，天津市四通化工厂；玉米浆 （试剂级）：金丰玉米有限公司；糖化酶（100 000 U/mL）： 上海源叶生物科技有限公司；耐高温的 α-淀粉酶 （20 000 U/mL）：诺和诺德（中国）生物技术有限公司；玉 米蛋白粉、麸皮粉、豆饼粉：鄢陵胜源豆业有限公司。

LS-B50L 型立式压力蒸汽灭菌锅、SPX-250B-Z 型生化培养箱：上海九州网址实业有限公司医疗设备厂； CX23 型光学显微镜：OLYMPUS 公司；HZQ-QX 恒温 振荡器：中国哈尔滨市东联电子技术开发有限公司； FA2004N 电子天平：上海精密科学仪器有限公司；50 L 发酵罐：镇江东方生物工程设备技术有限公司。

马铃薯葡萄糖琼脂 （potato dextrose agar，PDA）培 养基：马铃薯削皮切块，称取 200 g，加入适量蒸馏水煮 沸 30 min，4 层纱布过滤除渣，取清液加蒸馏水定容 至 1L，加入 2 %葡萄糖充分溶解，加入琼脂粉 20 g， 121 ℃，20 min 灭菌。制成斜面或平板备用。

由于此前黑曲霉 zs-10 是经过 γ 射线（Co60）诱变 后筛选得到的菌株，因此采用高剂量 γ 射线（Co60）进 行孢子悬浮液诱变，选用 γ 射线（Co60）处理的剂量分别 为 1 000、1 200、1 400 Gy，其致死率与正突变率见表 1。

由表 1 可以看出，Co60 诱变的致死率和菌种正变率 都随着处理时间的增加而升高，在处理剂量为 1 400 Gy 时，正变率达到 30.6 %。所以选取诱变剂量为 1 400 Gy。温度是影响黑曲霉发酵过程的一个重要因素。温 度过低，细胞内控制酶合成的关键酶的活性受到抑 制，合成柠檬酸的生物反应趋向停滞状态，温度偏高， 可能会造成微生物细胞中关键酶的不可逆失活，是微 生物代谢减慢。实验室内的摇床三角瓶发酵，调节合适的发酵初 始 pH 值十分重要。特别是像柠檬酸发酵这种以淀粉 作为发酵原料的发酵，发酵液初始 pH 值的高低会直 接影响到菌体糖化酶的活力，由于柠檬酸发酵是以玉 米粉为原料的发酵过程，属于边糖化边生长边产酸的 过程。

以菌种 zs-10 为出发株，经过 γ 射线（Co60）及亚硝 基胍复合诱变，得到一株高产柠檬酸且遗传稳定性高的诱变菌株 zs-10-5。通过对种子培养条件和发酵条 件的优化，最终发现种子以豆饼粉为氮源，初总糖浓 度 10 %培养 24 h 左右形成菌丝球性能最好。发酵最 适温度 35 ℃，初始发酵在 pH5~6，以豆饼粉为氮源为 0.8 %，通过 50 L 发酵罐进行了验证，其发酵结果为周期 63 h，产酸 17.94 g/100 mL，发酵指数为 2.85 kg/（m3 ·h）， 转化率为 99.7 %。

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