霉菌培养箱在金针菇中的作用！
来源：未知
发布日期：2019-07-26 16:37【大 中 小】
本文对影响金针菇原生质体制备和再生的因素进行研究,并筛选出金针菇原生质体制备和再生的最佳条件,为采用细胞工程技术培育金针菇优良菌种打下了基础。
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不同的接种方法对原生质体的再生有很大的影响,本实验上海博讯分别采用直接涂抹法和双层培养法进行实验,双层培养法几乎没有菌落再生。原因可能是冬季操作,双层培养基的上层半固体培养基温度难以控制,致使原生质体死亡。
原生质体虽然失去了细胞壁存在时的原有细胞形态,变成了圆球体,但它仍然具有原生质膜和整体基因组,仍保持着细胞的生理学、生化学和遗传学的特性和功能,并能再生和回复成一个具壁细胞,因此已成为生理学和遗传学的研究材料。影响原生质体形成的因素很多,本文上海博讯比较了酶浓度、酶系组合、渗透压稳定剂及酶解时间等因素的影响。用酶法破壁制取原生质体,酶的作用无疑是关键,不同种或者同一种不同分布区域的菌体由于其细胞壁的结构可能存在差异而需要不同的酶系统,而且,酶的质量、纯度对原生质体的形成也有着非常大的影响。真菌细胞壁是由几丁质、纤维素和无定型葡聚糖层组合的复合体,因此在一般情况下,采用具有分解几丁质、纤维素的裂解酶即能制备出原生质体。
本实验上海博讯采用纤维素单酶进行裂解,发现需时较长,而且产量很低。采用纤维素酶与其它酶的混合体系则大大缩短了酶解时间,原因可能在于不同酶之间存在作用的互补。本实验上海博讯筛选出的最佳酶系组合是纤维素酶与溶菌酶的混合,并且分别以1%的浓度混合较为适宜。浓度过高,易造成原生质体不稳定而变形,甚至破裂,产量反而下降也不经济;浓度太低,破壁困难则原生质体产量不足。渗透压稳定剂作为裂解酶的作用环境和原生质体的存在环境,对原生质体的释放和再生产生重要的影响。稳渗剂的性质、浓度一定程度上会促进酶的反应活性,同时也是维持和控制原生质体数量的主要因素。常用的渗透压稳定剂有无机型和有机型两大类,对食用菌来说,渗透压稳定剂用无机盐似乎比有机型的要好。这可能与丝状真菌原生质体为保持代谢活性利用醇、糖而改变周围环境,包括pH、渗透压以至改变稳定性,从而影响破壁效果有关,这与本实验的结果一致,并且以KCl为稳渗剂的效果最好,可以获得最高产量且原生质体比较稳定。
本次实验选用的三种无机盐类稳渗剂KCl、NaCl、MgSO4·7H2O对原生质体的再生没有明显不同的影响,但是作者在实验中发现采用MgSO4·7H2O作稳渗剂的培养基凝固性差。酶解时间也是影响原生质体释放的重要因素。上海博讯本实验结果表明,25℃下,酶解1.5h获得的原生质体最多,大小也比较均匀,随着酶解时间的延长,原生质体数量开始减少,主要原因可能是酶继续作用于膜系统使膜破裂所致。另外在酶解过程中,要间隔一段时间伴以轻微振荡,以利于原生质体与菌丝体分离开来。此外,酶解温度和菌丝体的菌龄对原生质体的释放也产生了很大的影响。酶解温度主要影响酶的活力和菌体的生理状态,由于金针菇菌丝生长的最适温度是25℃,纤维素酶和溶菌酶的酶活性最适温度为25～35℃之间,所以作者采用的酶解温度为25℃。菌丝体的菌龄对原生质体释放的影响主要在于细胞壁的成份和结构发生了变化。酶解时,首先菌丝顶端见到原生质体释放,因为尖端部分是新合成的壁,成分相对简单,壁也相对薄些。随着菌龄的增加,壁不断沉积色素等物质,阻碍了酶的作用,使壁难以解体释放原生质体。
在本实验中,上海博讯采用摇瓶培养的菌丝生长较快,4d即可获得大量菌丝。但是作者在实验过程中发现金针菇菌丝在摇瓶培养时易团化,另外分泌粘性物质很多,不利于洗涤和酶解。因此采用摇瓶培养的菌丝制备原生质体时,应先采取措施使菌团充分散化,使菌丝细胞壁外露,以利于随后的振荡洗涤及各种裂解酶的渗入而起作用。这将在以后的实验中进一步探讨。而采用玻璃纸平板培养的菌丝虽然生长较慢,10d才能得到适用的菌丝,但制取原生质体方便,效果较好。同样,影响原生质体再生的因素有很多本文进行了培养基、渗稳剂、接种方法等因素的影响的研究。培养基成分不同会导致新合成的细胞壁结构的差异,这种差异又导致了对酶敏感度反应不一,从而使菌丝细胞释放的原生质体再生有差异。
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