滇重楼 Paris polyphylla Sm. var. yunnanensis (Fr.) H. M. 为百合科重楼属 Paris L. 植物，主要分布于贵 州、云南和四川等地区，是《中国药典》2015 年版收 载的重楼药材的基原植物之一，其干燥根茎入药，具 有清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊的功效，是“云 南白药”“宫血宁胶囊”等多种中成药的主要原料， 市场需求量较大。市场上的重楼药材多年以来主要依 赖于野生采挖，导致野生滇重楼药材几近枯竭，寻 求合适的栽培驯化滇重楼的方式迫在眉睫。

1 材料与试剂

2012 年 10 月，滇重楼 2 年生育苗的鲜种采自 云南省大理州农业科学院种植基地；2013 年 10 月， 滇重楼 1 年生实生苗和育苗栽培种源的鲜种采自贵 州省种植基地，滇重楼育苗野生种源的鲜种采自贵 州省野生环境，常温下河沙贮存 4 个月，并经三峡 库区道地药材绿色种植与深加工重庆市工程实验 室（重庆三峡学院）周浓教授鉴定为百合科植物滇 重楼 Paris polyphylla Sm. var. yunnanensis (Fr.) H. M. 的成熟种子，种子采用单株保存、保证种质资 源的稳定性和均一性。

1.1 AM 真菌

通过美国国际丛枝菌根真菌种质资源保藏中心 购得相应的 AM 真菌纯净菌剂，其菌剂由三峡库区道 地药材绿色种植与深加工重庆市工程实验室（重庆三 峡学院）进行扩增繁殖、储存保管。接种菌剂为带有 孢子、菌丝及侵染后根段的栽培基质，见表 1。

1.2 试药

对照品重楼皂苷 I（批号 ）、重 楼皂苷 II（批号 ）、重楼皂苷 VI（批 号 ）、 重 楼 皂 苷 VII （批号 ）购自中国食品药品检定研究院，质 量分数均大于 98%。乙腈（德国默克公司，色谱纯）， 水（娃哈哈纯净水）。

1.3 仪器

DZF-6050MBE 型电热恒温真空干燥箱（上海博讯实业有限公司）；CP225D 型分析天平（德国 Sartorius 公司）；TDZ5-WS 型多管架自动平衡离心 机（湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司）； SB-5200DTN 型超声波清洗机（宁波新芝生物科技 股份有限公司）；LC-20A 型高效液相色谱仪、 UV2450 型紫外可见分光光度计（日本岛津集团）。

2 方法

2.1 实验设计

种子前处理，去除外果皮，用蒸馏水洗净，10% NaClO 溶液浸泡 15 min 后用蒸馏水洗净，备用； 紫云英种子用 10% NaClO 溶液浸泡 15 min 后用蒸 馏水洗净，备用。育苗栽培基质为菜园土与河沙的 混合物（体积比 3∶1，过 2 mm 筛，121 ℃高压 灭菌锅内灭菌 2 h）。2013 年 1 月、2014 年 1 月分 别将滇重楼 2 年生、1 年生实生苗育苗，采用室内 常温栽培法，设置 9 个处理组（AM 真菌组，S1～ S9）和 1 个对照组（CK 组，S10）共 10 组，每组 重复 10 次，每盆接种 180 个孢子的混合菌剂（均 分），与紫云英混合播种培养，待滇重楼种子出土 后除去紫云英植株，每盆间苗 20 株。滇重楼栽培 种源及野生种源新鲜种子于 2014 年 01 月与 AM 真菌混合共生育苗，采用室内常温栽培方法，设置 9 个处理组（AM 真菌组，S1～S9）和 1 个对照组 （CK 组，S10）共 10 组，每组重复 10 次，每盆接 种 180 个孢子的混合菌剂（均分），与紫云英混合 播种培养，待滇重楼种子出土后除去紫云英植株， 每盆间苗 20 株。滇重楼幼苗生长期间定期浇 Hoagland 营养液。 于 2015 年 6 月，采集栽培种源滇重楼育苗（T1） 和 1 年生滇重楼实生苗（T5）待测滇重楼样品，于 2015 年 7 月，采集 1 年生滇重楼实生苗（T6）待测 滇重楼样品，于 2015 年 8 月，采集栽培种源滇重楼 育苗家种（T2）、野生种源滇重楼育苗野生（T4）、1 年生滇重楼实生苗（T7）和 2 年生滇重楼实生苗（T8）待测滇重楼样品，于 2016 年 8 月，采集种子栽培种 源滇重楼育苗（T3）待测滇重楼样品。收获滇重楼的 根茎、根系，洗净后置于 35 ℃烘箱烘干，用于品质 分析；在冰水浴中洗净根系，剪成 1.0～1.5 cm 长的 根段，一部分置于福尔马林-醋酸-70％乙醇（FAA） 固定液中固定后用于菌根侵染率的测定。

2.2 AM 真菌的侵染率

随机选取浸泡于 FAA 固定液中滇重楼根系 30 条，采用 Philips 等的方法染色、制片、镜检，根 据 Trouvelot 等的方法统计菌根侵染率。

2.3 滇重楼幼苗叶片光合色素含量及生理指标的测定

根据张志良等的方法对滇重楼幼苗光合色 素含量测定；过氧化氢酶（CAT）活性采用紫外分 光光度法测定；过氧化物酶（POD）活性采用愈创 木酚显色法测定；超氧化物歧化酶（SOD）活性采 用氮蓝四唑法测定；丙二醛（MDA）和可溶性糖含 量采用硫代巴比妥酸法测定；可溶性蛋白含量采用 考马斯亮蓝比色法测定。

2.4 滇重楼幼苗生物量的测定

采收滇重楼后，测定各处理组新鲜根茎质量 后，分别置于 35 ℃烘箱中干燥至恒定质量，测定 不同处理组干质量，计算其折干率。

2.5 不同接种时期滇重楼幼苗根茎中重楼皂苷含量测定

采用《中国药典》2015 年版重楼药材项下测定 4 种重楼皂苷的含量。

2.6 数据分析

采用Microsoft Excel 2003软件作图，运用SPSS 20.0 进行统计分析。

3 结果与分析

不同接种时期滇重楼幼苗根系均 在一定程度上受到了 AM 真菌的侵染，除 CK 组未 被侵染外，其他处理组的侵染率在 91.29%～ 100.00%，各实验组均无显著性差异（P＞0.05）， 这与周浓等的研究结果一致。而在自然条件下， AM 真菌的侵染率为 36.41%～83.7%。综上可知， 接种外源AM 真菌对滇重楼根系菌根侵染率具有一 定的促进作用，说明通过外源接种 AM 真菌以提高 滇重楼的品质具有可行性。与 CK 组相比，不同接种时期滇重楼 3 种保护酶 CAT、POD 和 SOD 的活性有不同 程度的提高。其中，T1、T5 时期的 POD 与 SOD 活 性提高更为显著。在不同的处理组中，S6、S8、S9 的 3 种酶活性提高更为明显。3 种保护酶的活性表 现为 POD＞SOD＞CAT，可能是因为 POD 活性对 环境变化表现的更为敏感。表明接种 AM 真菌有利 于滇重楼叶片保护酶活性提高。

4 讨论

研究结果表明，各处理组均能与 AM 真菌形成 一定的共生关系，但各处理组对滇重楼生长发育情 况的影响程度存在差异。与 CK 组相比，菌根化滇重楼的侵染率良好，即 AM 真菌与滇重楼幼苗 根茎形成了菌根，说明通过引入外源丛枝菌根真菌 可提高滇重楼幼苗的生活力。接种 AM 真菌有助 于光合色素含量的提高，进而促进滇重楼的生长发 育。现有研究表明，AM 真菌能激活植物对多种生 物或非生物胁迫的防御机制，从而提高植物的抗逆 性，包括对病虫害、重金属污染、盐害、干旱等胁 迫的抗性。CAT、POD 和 SOD 作为植物体内清 除自由基的关键保护酶，能起到清除活性氧、维持 氧代谢平衡的重要作用。与 CK 组相比，不同接 种时期滇重楼的 3 种保护酶活性均大于对照组，说 明接种 AM 真菌增强了植株对不利环境的抗性。 植株体内的渗透调节物质包括可溶性糖、可溶性蛋 白，其能帮助维系植物细胞内的膨压进而利于增强 植株的抗逆性。与对照组相比，滇重楼叶片的可溶 性糖的含量均有明显的增加，但可溶性蛋白变化不 明显。细胞膜系统的损伤是植物水分胁迫的重要原 因，叶片中 MDA 含量的增多与膜相对透性呈显著 正相关。各接种时期的 MDA 含量均低于对照 组，表明接种 AM 真菌的各处理组降低了受逆境 环境的胁迫程度。