糖尿病肾病( diabetic nephropathy，DN) 是糖尿病微血管并发症的主要并发症之一，并且是导致终末期肾病( end stage renal disease，ESＲD) 的主要原 因。DN 的主要病理变化包括肾小球肥大、肾小 球基底 膜 增 厚、细胞外基质积聚以及肾纤维化等。肾小管上皮细胞-间质细胞转分化( epithelial-mesenchymal transition，EMT) 是导致肾纤维化的 重要机 制 之 一。

1 材料

1． 1 仪器

上海九州网址HPX-9272MBE电热恒温培养箱 ; 酶标仪( 美国 BioTek 公司) ; 高速冷 冻离心机( 美国 Sigma 公司) ; 倒置显微镜( 日本 Olympus 公司) ; 超净工作台( 苏净集团苏州安泰空气 技术有限公司) ; 脱色摇床( 海门市麒麟医用仪器 厂) ; Western 电泳-转印电源( 美国 Bio-Ｒad 公司) ; 半干转印系统( 美国 Bio-Ｒad 公司) ; 双红外激光成 像系统( Odyssey 公司) 。

1． 2 试药

大黄素( 徐州医科大学药学院实验室 提取) ，纯度检测见结果“3． 1”。DMEM 培养基( 美 国 Invitrogen Gibco 公司，ＲEF31600-034) ; 雷帕霉素 ( 美国 CST 公司，货号: 9904s) ; p-mTOＲ( Ser2448) 抗 体( 美国 CST 公司，货号: 5536) ; p-P70S6K 抗体( 美 国 CST 公司，货号: 9234) ; 兔抗 α-SMA 单克隆抗体 ( 货号: 1184-1) ; 兔抗 E-Cadherin 单克隆抗体( 货 号: 5409-1) ( Abcam 公司) ; β-actin 抗体( 美国 Biworld 公司，货号: AP0060) ; 胎牛血清( 依克赛公司， 批号 FSPl00) ; 荧光二抗( 奥德赛公司，批号 C40721- 02) ; 抗荧光猝灭封片液( 编号: P0126) 、PMSF( 编 号: ST506) ( 碧云天生物技术研究所) 。青霉素-链 霉素溶液( 100 × ，编号: C0222) 、BCA 蛋白浓度测定 试剂盒( 编号: P0010) 、Western 一抗稀释液( 编号: P0023A) 、Western 二抗稀释液( 编号: P0023D) 、ＲAPI 裂解液( 编号: P0013B) 均购自于碧云天生物技术 研究所。

1． 3 药液配制

精密称取雷帕霉素 18． 28 mg，溶 解于 1 mL DMSO 中，配制成浓度为 20 mmol·L － 1 的 母液分装，稀释为 20 μmol·L － 1 的二级母液保存。 给药时每 1 mL 培养基加入 1 μL 浓度为 20 μmol· L － 1 的雷帕霉素，使得培养液雷帕霉素的终浓度为 20 nmol·L － 1 。大黄素用 DMSO 配成 50 mmol·L － 1 母液，-20 ℃保存。临用前用 DMEM 高糖稀释成 1， 2． 5，5，10，20，40，80，160 μmol·L － 1 。

1． 4 实验细胞

人近端肾小管上皮细胞( HK-2) ， 购自上海复祥生物科技有限公司( 来源于 ATCC， CＲL-2190) ，购入后接种于含 10% 新生牛血清、1 × 105 U·L － 1 青霉素、100 mg·L － 1 链霉素、3． 7 mg·L － 1 碳酸氢钠的 DMEM 培养液中，于 37 ℃、5% 二氧化 碳，培养箱中培养，每 2 ～ 3 d 传代 1 次。

2 方法

HK-2 细胞以适当密度接种，同 步化 12 h 后，分为正常组( NG 组，5． 56 mmol·L － 1 葡 萄糖) 、甘露醇组( MA 组，5． 56 mmol·L － 1 葡萄糖 + 54． 44 mmol·L － 1 甘露醇) 、高糖组( HG 组，60 mmol· L － 1 葡萄 糖) 、溶 剂 组 ( 5． 56 mmol·L － 1 葡 萄 糖 + 0． 1% DMSO) 、大黄素组( EMO 组，60 mmol·L － 1 葡萄 糖 + 10 μmol·L － 1 大黄素) 和 mTOＲ 抑制剂组( Ｒapamycin 组，60 mmol·L － 1 葡萄糖 + 20 nmol·L － 1 雷帕霉 素) 。用 DMEM 培养 基制成 4 × 107 /L 细胞悬液，接种于 96 孔培养板，培 养 24 h 弃上清，加人无血清正常 DMEM 培养基，同 步化 12 h 后，在正常 DMEM 的基础上给予不同浓度 的大黄素，培养 72 h 后，每孔加入 MTT 溶液 20 μL， 于 37 ℃、5% 二氧化碳，培养箱中孵育 4 h 后，用酶 标仪在波长 490 nm 处测定各孔光密度值( D) ，实验 重复 3 次。HK-2 细胞按各处理因素处理 72 h 后，冰上裂解、提 取细胞总蛋白，采用 BCA 蛋白定量试剂盒测定蛋白 浓度。取 55 μg 蛋白上样量，经 8% 的 SDS-PAGE 电泳，用电转印法将凝胶上的蛋白转移至 NC 膜，室温 封闭 1 h，加抗 p-mTOＲ、p-P70S6K、p-4-EBP1、E-cadherin、α-SMA 抗体( 1 1 000) ，4 ℃ 过夜，PBST ( 5 min /3 次) ，充分洗涤后，孵荧光二抗( 11 000) ，室 温 1 h，Odyssey 仪器拍照，Image J 软件分析条带灰 度值。应用 SPSS 17． 0 统计软件处理， x ± s 表示，2 组间比较采用 t 检验，多组间比较采用 单因素方差分析( one-way ANOVA) ，若数据不符合 方差齐性，则采用 Dunnett’s T3 检验。P ＜ 0． 05 表 示差异有显著性。

3 结果

色谱柱: Agilent ZOＲBAX SB-C18 ( 4． 6 mm × 250 mm，5 μm) ; 流 动相: methanol-water ( 7525，phosphoric acid adjusted pH 2． 8 ) ; 检 测 波 长: 225 nm; 流 速: 1． 0 mL· min － 1 ; 柱温: 35 ℃甘露醇组与正常组比较差异无显 著性( P ＞ 0． 05) ; 溶剂组与正常组比较差异无显 著性( P ＞ 0． 05) ; 1，2． 5，5，10 μmol·L － 1 EMO 与 正常组比较差异无显著性 ( P ＞ 0． 05 ) ; 20，40， 80，160 μmol·L － 1 EMO 与正常组比较差异有显著性( P ＜ 0． 05 或 P ＜ 0． 01) ，提示大黄素浓度为 1，2． 5，5，10 μmol·L － 1 对正常培养的细胞毒性很 小。考虑到大黄素对高糖诱导的肾小管 EMT 的 抑制作用，故选择对正常细胞生长无影响的 10 μmol·L － 1 作为干预浓度。正常培养的 HK-2 细胞呈现典型的鹅卵石铺路 样分布，高糖培养的 HK-2 细胞形态从正常的圆形 或椭圆形转变为长梭形的纤维化样形态，给予大黄 素培养后，细胞形态逐渐变回椭圆形，给予雷帕霉 素后细胞同样由长梭形变成椭圆形或鹅卵石铺 路样。

4 讨论

DN 是糖尿病较为常见的并发症，其病理变化 呈慢性进行性进展，最终导致终末期肾衰竭和患者 死亡。DN 晚期常表现为肾小球硬化和肾间质纤维 化，其中肾小管 EMT 是肾间质纤维化的重要原因之 一。Iwano 等实验证明，肾间质纤维化的间充 质细胞，36% 来源于肾小管上皮细胞，说明 EMT 是 间质成纤维细胞的主要来源，也是肾间质纤维化的 中心环节。mTOＲC1 的异常激活参与了糖尿病状态 下多个病理进程包括 DN，以及肾纤维化等。



 

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