急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）是一种恶性血液系统肿瘤疾病， 也是儿童时期最常见的恶性肿瘤，占儿童恶性肿 瘤的 35%。ALL 的临床症状主要表现为贫血、肝 脾肿大及免疫能力低下，对患者健康危害严重 。 ALL 的发病机理较为复杂，对其机理目前尚未完 全明确。microRNA 是一类存在于真核细胞中的 非编码小 RNA 分子，可特异性的抑制某些 mRNA 的表达，从而对细胞的生长、凋亡等重要生理活 动产生作用 。

材料和方法

试剂及仪器

TRIzol 试剂购自美国 Invitrogen 公司；胎牛血清购 自美国 Hyclone 公司；ECL 试剂盒购自武汉艾美 捷科技有限公司；增殖细胞核抗原（PCNA）、 Caspase 3、Cyclin D1 及 MMP-9抗体均购自美国 Cell Signaling 公司；PVDF 膜购自美国密理博公司； 双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自北京索莱宝 科技有限公司；BCA 蛋白浓度测定试剂盒购自上 海威奥生物科技有限公司；FACSCanto 流式细胞仪 购自美国 BD 公司；DYCZ-24A 型双垂直电泳仪购自北京六一仪器厂；PCR 系统购自瑞士 Roche 公 司；超净工作台购自上海九州网址医疗生物仪器股份有限公司；CO2 细胞培养箱购自上海精密仪器仪表 有限公司。 临床标本采集 2018 年 5 月至 2018 年 11 月在本院确诊的 ALL 患 儿 23 例，其中男 14 例，女 9 例，年龄 8.9 ±2.3 岁， 参照张之南主编《血液病诊断及疗效标准》进行 诊断。患儿家属均签署知情同意书，且本研究经 医院伦理委员会批准。患儿的骨髓样本均在治疗 前采集，以防止药物对骨髓样本的干扰。采集患 儿骨髓样本 2 m1 后，置于含 K2EDTA 的抗凝管中， 加入 Ficoll 分离液进行密度梯度离心，以提取骨髓 单个核细胞（BMNC），置于液氮保存。 细胞培养及转染 采用含 10% 胎牛血清、5 μg/ml 青链霉素的 RPMI 1640 培养液，置于 37 ℃、5% CO2 的保温箱培养， 每 2-3 d 传代 1 次。细胞转染步骤：将 BMNC 接种 至 24 孔 板， 分 为 对 照 组（Control 组），miR-221 阴 性 对 照 组（miR-221-NC 组）及 miR-221 转 染 组（miR-221 组），待细胞培养至对数期，按照 Lipofectamine 2000 试剂盒说明书进行转染操作， 并于 37 ℃、5% CO2 条件下培养。 ALL 细胞 miR-221 水平的 RT-PCR 检测 各组细胞转染后培养 24 h，采用 TRIzol 试剂盒提 取细胞总 RNA，检测 RNA 纯度后，通过逆转录试 剂盒合成 cDNA。按照 miRNA 荧光定量 PCR 试剂盒说明书检测 miR-543 水平，以 U6 为内参，miR221 上 游 引 物：5′-CTGACTGCGTCACTGC-3′； 下 游 引 物：5′-CTGACGTGCAGTGCAC-3′。U6上游 引物：5′-GCGTACTGCGTGCATC-3′；下游引物： 5′-GACACTGCAGTCACTC-3′。PCR 反应步骤为： 95 ℃ 2 min；然后 95 ℃ 30 s，62 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s， 共 32 个循环，采用 2- △△ Ct 法计算基因的相对水平。

结 果

转染后各组 ALL细胞的 miR-221水平 miR-221 组的 miR-221 的表达水平显著高于对照组 及 miR-221-NC 组（P＜ 0.05）（图 1）。

转染后 ALL 细胞增殖水平的变化 转染 2、3、4 和 5 d 后，miR-221 组 BMNC 细胞增 殖水平显著低于对照组及miR-221-NC组（P＜ 0.05） （图 2）。

讨 论

ALL 是儿童时期较为常见的血液疾病，临床症状 主要表现为免疫功能减弱、贫血、发热及血小板 数量下降等 。在 ALL 治疗过程中，由于需要长期的化疗干预，往往会产生不良反应，对患儿健 康及生活也产生严重危害，有临床研究发现，儿 童急性淋巴细胞白血病治愈率较低，且容易复发， 严重影响治疗效果 。乳腺癌患者 的肿瘤组织中 miR-221 水平显著下降，这与患者预 后密切相关。miR-221 在肺癌、肝癌等多种癌细 胞中表达水平显著下降，通过上调细胞中 miR-221 水平，可抑制癌细胞增殖及迁移。因此，需 进一步分析 miR-221 对 ALL 细胞抑制效果，以期 为提高患儿治疗效果提供实验参考。