脊髓损伤（ｓｐｉｎａｌｃｏｒｄｉｎｊｕｒｙ，ＳＣＩ）具有致残率 高、后期康复及生活负担重等特点，骨髓间充质干细 胞（ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｓｔｅｍｃｅｌｌｓ，ＢＭＳＣｓ）作为种子细胞 定向移植可 促 进 ＳＣＩ修 复 及 功 能 恢 复 已 得 到 广 泛 的证实。但是，ＢＭＳＣｓ定向移植后因细胞生长环 境改变、脊髓原发性损伤炎性反应以及脊髓损伤后 相关抑制性信号通路开放所致继发性损伤导致移植 细胞出现凋亡、生长缓慢、分化抑制等难题。相 关文献认为继发性损伤所导致的病理生理变化对神 经功能恢复起决定性作用，而相关抑制性信号通路 开放所致趋 化 因 子 和 细 胞 因 子 的 活 化 正 是 ＳＣＩ后招募、激活炎性细胞的扳机点，从而进一步加重 ＳＣＩ 的继发性损 伤。

１ 材料与方法

１．１ 实验动物及分组

选 取５只 周 龄 为３～４周、 体质量为１００ｇ健 康 雄 性 ＳＤ 大 鼠 用 于 ＢＭＳＣｓ的 提取，选取８０只周龄为８周、体质量３００ｇ雄性ＳＤ 大鼠用于制作模型。ＳＤ大鼠均为清洁级，由新疆医 科大学动物饲养中心提供，本研究经新疆医科大学 第一 附 属 医 院 动 物伦理委员会批准 （编 号： ＩＡＣＵＣ２０１６１２０８－０５）。将８０只 大 鼠 根 据 不 同 实 验 干预措 施 随 机 分 为 ＳＣＩ模 型 组、ＢＭＳＣｓ移 植 组、 Ｆａｓｄｉｕａｌ治疗组、联合治疗组（２０只／组）。

１．２ 试剂及仪器设备

胎牛血清、低糖 ＤＭＥＭ 培 养基、ＰＢＳ缓冲液、双抗、０．５％胰蛋白酶（美国 Ｈｙ－ ｃｌｏｎｅ公司）；神经元性特异性烯醇化酶（ＮＳＥ）抗体、 胶质纤维酸性蛋白（ＧＦＡＰ）抗体及四甲基异硫氰酸 罗丹明（ＴＲＩＴＣ）标记的羊抗兔ＩｇＧ 抗体、二脒基苯 基吲哚（ＤＡＰＩ）复染液（武汉博士德公司），神经丝蛋 白（ＮＦ２００）抗 体（北 京 博 奥 森 公 司）。超 净 工 作 台 （苏净安泰），高速离心机（美国 Ｔｈｅｒｍｏ公司）倒 置 相差显微镜（ＣａｒｌＺｅｉｓｓ），恒温培养箱（上海九州网址医疗股份有限公司），图像采集设备（ｆｅｃｉａＤＭ３０００）。

１．３ ＢＭＳＣｓ的提取、培养、纯化及鉴定

无菌条件 下取出５只周龄３～４周、体质量为１００ｇ大鼠的双 侧股骨及胫骨，置 于５％双 抗 的 ＤＭＥＭ 中，用 低 糖 ＤＭＥＭ 反复冲洗骨髓腔，反 复 吹 打 成 单 细 胞 悬 液， 清洗、离心细 胞２ 次 去 除 肉 眼 可 见 的 杂 质 及 油 脂。 用含体积分数１２％胎牛血清的 ＤＭＥＭ 制作单细胞 悬液接种于 培 养 瓶 中，置 于３７℃、５％ ＣＯ２ 恒 温 培 养箱中培 养，７２ｈ 首次换液弃去未贴壁的 悬浮细 胞，之 后 每 ３ 天 换 一 次 液，当 细 胞 生 长 至 ８０％ ～ ９０％时，进行胰酶消化传代（１∶３传代），第３代 细 胞已经去除非贴壁的骨髓造血干细胞，得到纯化的 ＢＭＳＣｓ，使用流式细胞计数进行检测。移植前用毛 细吸管反复吹打分离细胞，制作单细胞悬液，ＰＢＳ洗 涤２次，调整细胞密度为１×１０６ 个／μＬ，移植备用。

１．４ ＳＣＩ大鼠模型制作

取ＳＤ大鼠用１０％水合氯 醛腹腔注射 麻 醉（３００ ｍｇ／ｋｇ）后，麻 醉 生 效 后 固 定 于解剖板上备皮消毒，以胸１０为中心做５ｃｍ 长切 口，逐层分离暴露胸９、１０、１１棘突和椎板，咬除棘突 及椎板充分暴露脊髓。根据改良 Ａｌｌｅｎ法用５ｇ砝 码从１６ｃｍ 高度通过适当粗细的玻璃试管自由下 落，砝码柄端朝下，打击面积约３．０ｍｍ２。砝码自由 落下打击到脊髓时大鼠迅速出现双下肢回缩扑动及 摆尾动作，随后出现迟缓性瘫痪，迅速移除砝码后可 见脊髓充血 水 肿，提 示 ＳＣＩ模 型 制 作 成 功，生 理 盐 水冲洗后逐层关闭切口。术后膀胱按摩３～５次／ｄ， 促进反射性排尿至恢复正常排尿，２０万 Ｕ／ｋｇ青霉 素皮下注射３～５ｄ预防切口及泌尿系感染。

１．５ 干预方法

ＳＣＩ模型组：脊髓损伤模型制作成 功后 逐 层 关 闭 切 口，３０ ｍｉｎ 后 腹 腔 注 射 １ ｍＬ 的 ０．９％氯化钠注射液。ＢＭＳＣｓ移植组：脊髓损伤模型 制作成功后３０ｍｉｎ腹腔注射１ｍＬ的０．９％氯化钠注 射液，术后５ｄ沿原切口切开暴露脊髓损伤节段，硬 膜下注射１０μＬ的１×１０６／μＬ骨髓间充质干细胞单 细胞悬液。Ｆａｓｄｉｕａｌ治疗组：脊髓损伤模型制作成功 后３０ｍｉｎ腹腔注射１ｍＬ的Ｆａｓｄｉｕａｌ（０．８５ｍｇ／ｋｇ）， 术后５ｄ沿原切口切开暴 露 脊 髓 损 伤 节 段，硬 膜 下 注射１０μＬ０．９％氯化钠注射液。联合治疗组：脊髓 损伤模型制作成功后 ３０ ｍｉｎ 腹 腔 注 射１ｍＬ Ｆａｓｄｉｕａｌ（０．８５ｍｇ／ｋｇ），术后５ｄ天沿原切口切开暴 露脊髓损伤节段，硬膜下注射１０μＬ１×１０６ 个／μＬ骨 髓间充质干细胞单细胞悬液。

１．６ 运动功能评分

由 本 课 题 组２名 研 究 人 员 采 用 ＢＢＢ（ｂａｓｓｏ－ｂｅａｔｔｉｅ－ｂｒｅｓｎａｈａｎ）评 分 法 分 别 于 ＳＣＩ术后第１、７、１４、２１、２８天同一时间段对各组大鼠 后肢运动功能进行评分，评分范围０～２１分，０分为无 后肢运动，２１分为后肢正常运动，评分取平均值。

１．７ 组织学观察

ＳＣＩ术后第２８天各组大鼠腹腔 注射１０％水合氯醛，麻醉处死各 组 ＳＣＩ大 鼠，按 原 切口进入，以损伤脊髓节段为中心切取约１ｃｍ 长度 完整脊髓组织，置于４％多聚甲醛固定４８ｈ，常规梯 度脱水、石蜡包埋。取蜡块制片，厚度４μｍ，６０℃烤 箱烤片过夜备用。切片经脱蜡、脱水、透明后分别进 行 ＨＥ、免疫组 织 化 学、免 疫 荧 光 染 色，镜 下 观 察 脊 髓标 本 形 态 学 结 构 以 及 ＮＳＥ、ＮＦ２００、ＧＦＡＰ 的 表达。

１．８ 免疫组织化

学 半 定 量 分 析 采 用Ｉｍａｇｅ－Ｒｒｏ－ Ｐｌｕｓ图像分析软件对免疫组织化学染色结果进行 分析，根据阳性染色细胞及染色强度计算出光密度 值，用于后续统计分析。

１．９ 统计学处理

数据采 用 ＳＰＳＳ１７．０软 件 进 行 统计分析，服从正态分布的计量资料以均数±标准 差 （ｘ－ ±ｓ）表示，组间比较采用方差分析，组间两两 比较 采 用 ＳＮＫ－ｑ，以 Ｐ ＜０．０５ 为差异有统计学 意义。

２ 结果

初次换液后原代细胞呈集 落分布于培养瓶，经传代后均匀生长，３代细胞均匀 分布，细胞呈梭形。３代细胞表型 ＣＤ２９、ＣＤ４５的阳 性率分别为８２．４％、２．０％，见图１。


各 组 ＳＣＩ大 鼠 术 后１ｄ评 分 均 位 于较低水平，运动范围为无运动到１～２个关节的轻 微运动，术后１～２８ｄ各组 ＳＣＩ大鼠运动功能均有 改善，以术后１４～２８ｄ改 善 幅 度 相 对 较 大，以 联 合治疗组运动改善效果最佳，联合治疗组在损伤第１４ 天开始ＳＣＩ大鼠 ＢＢＢ评分逐渐优于其余治疗组，且 差异有统计学意义 （Ｐ ＜０．０５），见表１。ＳＣＩ术后第２８天观察各组标本 ＨＥ 结果显示联合治疗组脊髓伤修复效果明显，脊髓空洞面积最 小，其 次 为 ＢＭＳＣｓ移 植 组 和 Ｆａｓｄｉｕａｌ治 疗组，而ＳＣＩ模 型 组 空 洞 面 积 最 大，损 伤 组 织 的 修 复效果较差，见图２。ＢＭＳＣｓ移植组、Ｆａｓｄｉｕａｌ治疗 组和联合治 疗 组 分 别 与 ＳＣＩ模 型 组 相 比 差 异 均 有 统计学意义 （Ｐ ＜０．０５），见表２。

３ 讨论

脊髓损伤（ＳＣＩ）由初始的原发性和渐进的继发 性两部分损伤共同所致。目前，因各种外伤 因 素 造成脊髓结构破坏的原发性损伤还无法可控，仅限 于手术解除压迫为脊髓恢复创造有利条件；然而，以 脊髓水肿、炎症反应、神经细胞凋亡、神经元不能再 生一系列联动的继发性损伤是可以干预的，也是当 前解决脊髓损伤再生修复的研究方向。脊髓损伤 后轴突再生和正确靶向是损伤后脊髓修复与功能重 建的难点，干细胞移植治疗脊髓损伤能很好解决这一难题，其 中 的 ＢＭＳＣｓ定 向 分 化 移 植 是 最 具 应 用 前景之一。但 由 于 ＢＭＳＣｓ移 植 于 损 伤 脊 髓 后 会继发性损伤出现移植细胞生存率下降、生长缓慢、 定向分化抑制等不利的方面。所以，本课题以此为 据点进行研究。