酱油是以大豆（或豆粕）、小麦（或麸皮）为主 要原料，以米曲霉制曲，加食盐发酵而成的一种 调味品。 早期，酱油生产以天然混菌发酵为主。 上 世纪 60～70 年代，为了提高氨态氮得率等指标，逐 步过渡到米曲霉纯种发酵。 上世纪末，酱油企业为 了改善酱油的风味，又纷纷尝试添加鲁氏酵母菌、 球拟酵母和乳酸菌发酵来提高酱油品质。

1 材料与设备

1.1 材料与试剂

豆粕、麸皮、AS3.042 米曲霉，老恒河酿造有限 公司；AS2.180 鲁氏酵母、 沪酿 2.14 球拟酵母、沪 酿 1.08 乳酸菌， 上海迪发有限公司； 氢氧化钠， 天津市科密欧化学试剂开发中心；浓盐酸（36%～ 38%），衢州恒化试剂有限公司；浓硫酸，衢州恒化 试剂有限公司； 葡萄糖， 广东光华化学厂有限公 司；硫酸钾，上海振新试剂厂；乙酸、3-甲基丁醛、 丁醇、乙酸乙酯、3-辛醇（内标），Alfa aecer 公司； 甲 醛（36%），杭州高晶精细化工有限公司；氯 化 钠，天津市科密欧化学试剂开发中心。

1.2 仪器与设备

HH-4 数显恒温水浴锅，上海九州网址；8HW-1 型 恒温磁力搅拌器，科大创新；pHS-3C 型酸度计，上海雷磁仪器厂；电子天平，上海精科；电子分析天 平，上海精科；721 可见分光光度计，上海精密科 学仪器有限公司；TN303-4 恒温培养箱，南京市江 宁电器仪器厂；3-Octanol（内标），Alfa aecer 公司； 30 m ×0.25 mm ×0.25 μm 毛 细 管 色 谱 柱 ；75 μm Carboxen/PDMS 萃 取 头 ；Agilient 5975C 气 相 色 谱-质谱联用仪，美国安捷伦公司；手动 SPME 进 样器。

1.3 方法

以 6∶4（w/w）的比例把原料豆粕与麸 皮均匀混合。 然后经过润水、蒸煮、冷却三个步骤 后， 按接种量为 0.3%接种沪酿 3.042 米曲霉单菌 种制曲。 在 35～37 ℃下，制曲 46 h。 1.3.2 酱油发酵 设置 4 个组，Ⅰ组为对照组，其 余Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 3 组为试验组。 每组称取成曲 10 kg， 然后与浓度为 19 °Bé 的盐水按照 1 ∶ 2 （曲 ∶ 盐水 w/w）的比例混合，进行发酵，温度为室温。 按照 表 1 的试验设计进行试验。 发酵开始的当天设为 0 d 开始取样，之后每隔 10 d 取样一次，测定在不 同时间段酱油发酵过程中理化指标的变化。 到 90 d 结束取样。

2 结果与讨论

对酱油中的氨基酸态氮含量、 糖化酶含量、 pH 值、还原糖含量与发酵天数的关系用 Origin 8 软件进行拟合， 可以得到酱油的理化指标与发酵 时间的函数。 酱油的 pH 等理化指标与发酵时间 的拟合曲线见图 1～图 3。

由图 1 可知， 发酵 90 d， Ⅳ组添加了鲁氏酵 母、 球拟酵母和乳酸菌制曲的酱油氨基酸态氮含 量最高，可达到 1.38 g/100 mL，Ⅰ组最低。 在发酵 过程中氨基酸态氮的含量趋势呈现先增加后平 稳。 在 50 d 以前，对照组高于试验组，50 d 后对照 组中的氨基酸态氮含量基本趋于平稳。 而试验组 中的氨基酸态氮在前 60 d 一直保持上升趋势，直 至 60 d 时才趋于平稳。 这是由于添加鲁氏酵母与 球拟酵母后，在前期酵母大量繁殖，消耗较多氨基 酸。 因此在 30～50 d 时，试验组中的氨基酸态氮低 于对照组。 而 50 d 后，由于对照组中的氨基酸与 糖类发生美拉德反应消耗氨基酸， 而试验组中的 这一过程发生在 60 d 后。由图 2 可知，pH 呈现出不断下降的趋势，这 是由于在发酵过程中， 由于酱油中有机酸的不断 产生。明显可以看出，pH 下降最快的为Ⅳ组。这是 由于Ⅳ组添加了乳酸菌，乳酸菌可以利用糖类、柠 檬酸生成乳酸和醋酸， 从而产生以上现象。 并且pH 下降至 5 附近， 抑制了非耐酸杂菌的生长，同 时促进酵母的繁殖与发酵。 另外，酸性物质赋予了 酱油爽适的风味，改善酱油的口感。 并且酸性物质 的生成抑制了非耐酸微生物的繁殖， 但可以促进 酱油酵母的生长与繁殖，以及酒精发酵。由图 3 可知，在发酵过程中，还原糖的含量呈 现先增加后减少的现象。 这是由于制曲时积累的 淀粉酶作用下，还原糖含量上升，和可利用多糖的 释放。 而后期，由于美拉德反应以及微生物代谢 消耗还原糖，导致还原糖含量下降。

3 结论

通过对添加不同菌种组合发酵所得酱油的理 化指标以及风味物质的测定， 发现多菌种制曲高盐稀态发酵的酱油特征风味物质含量更高， 品质 更好。 发酵过程中：（1）4 组的氨基酸态氮、 还原 糖、pH 等理化指标基本相似， 第Ⅳ组的氨基酸态 氮的值（1.378 g/100 mL）略 高 于 其 他 3 组；（2）鲁 氏酵母促进了酱油中高级醇及芳香杂醇的生成， 球拟酵母促进了酱油中 4-EG、4-VG 的 生 成，使 酱油具有特殊的香气， 乳酸菌发酵赋予了酱油爽 适的口感， 各组风味物质含量和种类差异非常显 著；（3）对特征性风味物质含量与发酵时间进行曲 线拟 合，可得到数学关系式（如 y=-230.83+21.7 t-0.136 t 2 +1.27×10-4 t 3 ，第Ⅰ组），从关系式算出Ⅰ 组特征性风味物质最大值分别为：648.96 μg/L（Ⅰ 组，发酵周期 92 d）、852.90 μg/L（Ⅱ组，发酵周期 98 d）、982.51 μg/L（Ⅲ组，发酵周期 99 d）、1 897.55 μg/L（Ⅳ组，发酵周期 102 d）。 多菌种发酵的酱油 获得了较高的特征性风味物质含量。 以上结果，对 酱油的多菌混合制曲发酵实践生产中有一定指导意义。