三叶青（ｒａｄｉｘｔｅｔｒａｓｔｉｇｍａｔｉｓｈｅｍｓｌｅｙａｎｉ），又名蛇附子、石老鼠、石猴子、石抱子等，为葡萄科崖爬藤 属植物三叶崖爬藤。它主要分布于中国浙江、安徽、江西、云南、贵州等地，具有清热解毒、消肿散结、活 血化瘀等功效。三叶青中含有多种有效的化学活性成分，多糖便是其中之一。研究表明，三叶青多糖 具有复杂的生物活性和功能，如降血糖、抗氧化、抗肿瘤、抗肝损伤、调节免疫等。目前研究人员提取三 叶青多糖的方法大多为传统的水提醇沉法、酸碱提取法、索氏提取法等，这些传统的提取方法普遍存在 提取温度高、耗时长、效率低、溶剂消耗大且多糖的空间结构易被破坏等缺点。

１ 材料与仪器

１．１ 材 料

纤维素酶（ＢＲ，国药集团化学试剂有限公司，批号２０１８０３０９）；葡萄糖（ＡＲ，天津市大茂化学试剂厂）；盐 酸（ＡＲ，上海凌峰化学试剂有限公司）；硫酸（ＡＲ，上海凌峰化学试剂有限公司）；苯酚（ＡＲ，杭州双林化工试 剂厂）；１，１－二苯基苦基苯肼（ＤＰＰＨ，ＡＲ，北京冬歌生物科技有限公司）；无水乙醇（ＡＲ，永华化学科技有限公 司）；ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ（ＡＲ，天津市大茂化学试剂厂）；水杨酸（ＡＲ，上海凌峰化学试剂有限公司）；３０％Ｈ２Ｏ２ 溶 液（ＡＲ，杭州高晶精细化工有限公司）；三叶青块根（浙江丽水三叶青珍稀植物研究所，产地浙江丽水）。

１．２ 仪 器

高速多功能粉碎机（永康市天祺盛世工贸有限公司，ＣＳ－７００）；电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限 公司，ＢＳ２２４Ｓ型）；循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限公司，ＳＨＺ－ＤⅢ型）；电热恒温水浴锅（杭州蓝天 化验仪器厂，ＤＫＳ－２４型）；７５２紫外可见分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）；冰箱（博西华家用电 器有限公司，ＢＣＤ－２１２型）；数显鼓风干燥箱（上海九州网址实业有限公司医疗设备厂，９０７０ＭＢＥ 型）；ｐＨ 计 （上海佑科仪器仪表有限公司，ＰＨＳ－３Ｃ型）。

２ 试验方法

２．１ 标准曲线的建立

２．１．１ 标准溶液的制备

准确称取干燥至恒重的葡萄糖５０ｍｇ于２５０ｍＬ容量瓶中，加去离子水溶解并稀释至刻度，摇匀，配 得葡萄糖标准溶液（０．２ｍｇ／ｍＬ）。

２．１．２ 最大吸收波长的确定

吸取１．０ｍＬ的葡萄糖标准溶液，置于１０ｍＬ具塞试管中，加去离子水至２．０ｍＬ，加６．０％苯酚溶液 １．０ｍＬ后，立即加入５．０ｍＬ浓硫酸混匀，静止１０ｍｉｎ，摇匀，室温放置２０ｍｉｎ。同时取２．０ｍＬ去离子 水作为空白对照。在分光光度计上测定波长４５０～５５０ｎｍ 处的吸光度，确定其最大吸收波长。根据 试验结果，吸收波长为４９２ｎｍ 时，样品溶液的吸光度最大，故本试验选取的吸收波长为４９２ｎｍ。

２．１．３ 葡萄糖标准曲线的绘制

精确量取葡萄糖标准溶液０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０ｍＬ，置于１０ｍＬ具塞试管 中，加去离子水至２．０ｍＬ，加６．０％苯酚溶液１．０ｍＬ后，立即加入５．０ｍＬ浓硫酸混匀，静止１０ｍｉｎ，摇 匀，室温放置２０ｍｉｎ。同时取２．０ｍＬ去离子水作为空白对照，按上述方法操作，于最大吸收波长处测其 吸光度，并绘制葡萄糖标准曲线。

２．２ 纤维素酶法提取三叶青多糖的工艺流程

将三叶青块根用粉碎机粉碎，准确称取三叶青粉末５．０ｇ及适量的纤维素酶，加入一定量的稀酸液 并结合ｐＨ 计调节溶液ｐＨ 值为５，在一定温度条件下提取三叶青多糖。一段时间后将其置于９０ ℃水浴 锅中灭活５ｍｉｎ，再经过抽滤得到滤液，将滤液于２５０ｍＬ 容量瓶中定容，以用于接下来多糖提取率的测定。

２．３ 三叶青多糖提取率的测定

三叶青多糖提取率的测定采用苯酚－硫酸法。从２５０ｍＬ容量瓶中取１．０ｍＬ试液于１０ｍＬ容量 瓶中并定容。再从１０ｍＬ容量瓶中精密移取０．５ｍＬ按２．１．３的方法测定样品吸光度，并按式（１）计算 三叶青多糖的提取率： Ｙ ＝ ［（Ｃ×Ｖ ×Ｄ）／Ｍ］×１００％。 （１） 式（１）中：Ｙ 为多糖提取率；Ｃ 为由标准曲线方程求得的多糖质量浓度，ｍｇ／ｍＬ；Ｖ 为待测液体积，ｍＬ；Ｄ 为稀释倍数；Ｍ 为样品质量，ｍｇ。

２．４ 单因素试验设计

在酶法提取三叶青多糖的过程 中，影响多糖提取率的主要因素 有酶 加 量、酶 解 时 间、酶 解 温 度、 ｐＨ、水料比（体积∶质量，ｍＬ／ｇ）、提取次数等。本试验选择酶加量、酶解温度、酶解时间、水料比这 ４个因素分别进行单因素试验。通过多次的预试验，对各单因素条件的固定提取条件进行了设置，具体见表１。

３ 试验结果与分析

以吸光度ｙ值为纵坐标，葡萄糖质量浓度ｘ 为横坐 标，制作葡萄糖标准曲线，如图１所示。标准曲线的回归 方程为：ｙ＝５７．７６７ｘ－０．０１７，Ｒ２ ＝０．９９９４，表明吸光度 在葡萄糖标准溶液质量浓度为０．００５～０．０３ｍｇ／ｍＬ范 围内线性关系较好。随着酶加量的增加，三叶青多糖提取率 增大，这一阶段影响三叶青提取率的主要因素是酶含量。当酶加量达到０．３％时，三叶青多糖提取率达到最大；之后再增大酶加量，三叶青多糖提取率反而有所降低。这是因为此时影响三叶青多糖提取率的 图２ 酶加量对三叶青多糖提取率的影响 Ｆｉｇ．２ Ｅｆｆｅｃｔｏｆｅｎｚｙｍｅｄｏｓａｇｅｏｎｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｙｉｅｌｄｏｆ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｆｒｏｍｒａｄｉｘｔｅｔｒａｓｔｉｇｍａｔｉｓｈｅｍｓｌｅｙａｎｉ 主要因素是底物的量，此时酶的用量已达到饱和，没有多 余的底物再有机会与纤维素酶反应；而且酶含量过高，也 可能会抑制酶的作用。因此，酶加量取０．３％。

4 结 语

采用纤维素酶法提取三叶青中的多糖，考察了酶加量、酶解温度、酶解时间及水料比４个因素对 多糖提取率的影响。通过单因素试验和响应面试验设计，明确了各因素对三叶青多糖提取率的影响大小 次序为：酶加量＞水料比 ＞ 酶解时间 ＞ 酶解温度。最佳提取工艺条件为：酶加量 ０．２７４％，酶解温度 ６０．５ ℃，酶解时 间 ６２．４ ｍｉｎ，水 料 比 ２５．８∶１，此 条 件 下 的 多 糖 实 际 提 取 率 为 １０．４７％。酶法提取三叶青多糖用时较短，提取率却更高。本试验得出的三叶青多糖提取优化工艺可为研 究与开发三叶青多糖提供试验基础。



 

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