酱油是以大豆（豆粕）和小麦等为主要原料，添加 米曲霉固态制曲和液态酱醪发酵制备的一种色、香、味 俱全的液体调味品。液态酱醪酿造过程中，各种微生 物的生理代谢和酶系的生化作用，使原料中蛋白质、淀粉、油脂等大分子被分解为小分子肽、游离氨基酸、有 机酸等小分子物质，赋予酱油丰富饱满的滋味和独特 的香气。

１ 材料与方法

１．１ 试验材料

米曲霉曲精（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）：山东市济宁玉 园生物科技有限公司；低温食用豆粕：山东市禹王实业 （集团）有限公司；原料面粉、食盐：均为市售。

１．２ 试验试剂

十二 水 合 磷 酸 氢 二 钠、二水合磷酸二氢 钠、浓 硫 酸、柠檬酸（一水）、三氯乙酸、乳酸、乳酸钠、氢氧化钠、 盐酸、甲醛及苯酚：均为分析纯；谷氨酰胺、酪蛋白及福 林酚试剂：均为生化试剂；肽分子量标品：色谱纯，购自 美国Ｓｉｇｍａ公司。

１．３ 试验主要仪器设备

ＨＹＰ－３０８消化炉、ＫＤＮ－１０３Ｆ 自动定氮仪 上海 纤检 仪 器 有 限 公 司；Ｂａｎｔｅ３２１－ＮＨ４ 铵 离 子 选 择 电 极 上海 般 特 仪 器 有 限 公 司；ＨＨ－４ 数 显 恒 温 水 浴 锅 江阴市保利科研器械有限公司；ＭＥ２０４Ｅ 分析天 平 梅特勒－托利多仪器（上海）有限公司；高效液相色 谱仪 美 国 Ｗａｔｅｒｓ 公 司；ＴＳ１００ 微 型 旋 涡 混 合 仪 器 杭州瑞诚 仪 器 有 限 公 司；ＤＨＧ－９０７０Ａ 鼓 风 干 燥 箱 上海慧 泰 仪 器 制 造 有 限 公 司；ＧＬ２１Ｍ 高 速 冷 冻 离心 机 长 沙 湘 智 离 心 机 仪 器 有 限 公 司；上海九州网址BXM-30R立式压力蒸汽灭菌器； ＺＸＪＰ－Ａ１４３０霉菌培养箱 上海智诚分析仪器制造有 限公司。

１．４ 试验方法

１．４．１ 主要工艺流程

本文采用高盐稀态酱油酿造方法（ＧＢ１８１８６－２０００）进行发酵，按１∶２．５（大 曲∶水）混 合 均 匀 后，在４ ℃ 冰箱进行酱醪发酵初期（９ｄ）的控温发酵，然后与１６％ （Ｗ／Ｗ）的盐混合，放在２５ ℃的恒温发酵箱中进行保 温 发 酵。 其 中 一 部 分 每 ２～３ ｄ 用 １０ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ 调控酱醪ｐＨ 值在６．５左右，为调控ｐＨ 酱醪； 另外一部分在自然 ｐＨ 值下进行发酵，为自然 ｐＨ 酱 醪。酱醪发酵的总周期为９０ｄ。酱油制备的主要工艺 流程见图１。

１．４．２ 谷氨酰胺酶活力和蛋白酶活力的测定

参考崔春等和 Ｎａｎｎｉｐｉｅｒｉ等的 方 法，采 用 离 子选择 电 极 法 测 定 谷 氨 酰 胺 酶 活 力。 参 照 ＳＢ／Ｔ １０３１７－１９９９《蛋白酶活力测定法》，采用福林酚法测定 蛋白酶活力。

１．４．３ 总氮和氨基酸态氮的测定

参照国家标准 ＧＢ１８１８６－２０００《酿造酱油》，采用 凯氏定氮法测定样品中的总氮含量，采用甲醛滴定法 测定氨基酸态氮含量。

１．４．４ 水溶性分子肽的分子量分布

采用凝胶色谱法测定肽分子量的分布。检测条件为 Ｗａｔｅｒｓ６００型高效液相色谱仪，ＴＳＫｇｅｌＧ２０００ＳＷＸＬ凝 胶色谱分析柱；洗脱液为含有０．１％三氟乙酸的磷 酸 盐缓冲液，流速为１ｍＬ／ｍｉｎ，检测波长为２２０ｎｍ。标 准肽样品相对分子质量的对数值与洗脱体积拟合直线 方程为 ｙ＝ －０．３５１ｘ＋７．６７７（Ｒ２ ＝０．９９２１），式 中： ｙ为标准肽分子量的对数；ｘ为保留时间。

１．４．５ 感官评价分析

采用定量 描 述 分 析（ＱＤＡ）方 法。感 官 评 定 小组由７名男生和５名女生（年龄在２５～４５岁）组成， 评价前对每位评价人员进行多次风味描述一致性的认 定培训。感官测评的标 准溶液为 ５ 种：甜 味 （蔗 糖， １％）、咸味（氯化钠，０．７％）、鲜味（谷氨酸钠，０．３５％）、 苦味（Ｌ－异亮氨酸，０．５％）、酸味（柠檬酸，０．０８％）。感 官评价采用 九 点 线 性 标 度 法，０～９ 分分别表示无感 觉、阈值感觉、感觉微弱、感觉中等、感觉强烈，采用雷 达图描述评价结果。

１．５ 数据分析

试验结果以两组发酵样平均数±标准差来表示， 所有试验均重复３次，使用 ＳＰＳＳ１６．０和 Ｅｘｃｅｌ２０１６ 软件分析数据并绘制相应图表。

２ 结果与讨论

滤渣中谷氨酰胺酶活力的变化趋势 与滤液中的变化趋势相似，也呈现出先快速下降后缓 慢下降，最后趋于消失的变化趋势。整体上，滤渣中调 控ｐＨ 的谷氨酰胺酶活力大于自然ｐＨ 的谷氨酰胺酶 活力。滤渣中的谷氨酰胺酶主要为不溶性的胞内酶。 随着发酵时间延长，微生物的新陈代谢作用产生多种 有机酸，韩铭海等通过筛选获得一株高产谷氨酰胺 酶菌 株，其 产 酶 的 最 适 ｐＨ 为 ６．２，在 ｐＨ＜５．８ 或 ｐＨ＞６．８时，谷氨酰胺酶活力显著下降，这与九州网址的试 验结果 基 本 一 致。所 以，在 发 酵 时 适 当 调 整 酱 醪 的 ｐＨ 值，可以保持谷氨酰胺酶活力。两个样品的中性蛋白酶活力均呈现 出先急速下降后缓慢下降的趋势。发酵０～１ｄ，不同 酱醪ｐＨ 发酵过程滤液中的中性蛋白酶活力均迅速下 降（Ｐ＜０．０５），但降幅相似。发酵１～１０ｄ，低温胁迫、 无盐发酵下，微生物得到充分的生长，各酱醪ｐＨ 发酵 的蛋白酶活力有轻微的提高。发酵１０～９０ｄ，蛋白酶 活力下降缓 慢，样 品 间 差 异 显 著（Ｐ＜０．０５）。至 发 酵 ９０ｄ，酶 活 力 很 弱，这可能与中性蛋白酶对不同酱醪 ｐＨ 的适应程度不同有关。

３ 结论

不同酱醪ｐＨ 发酵的酱油其谷氨 酰 胺 酶、蛋 白 酶 活力差别显著（Ｐ＜０．０５）。随 着 发 酵 时 间 的 延 长，酱 醪ｐＨ 不断下降至５．０以下，谷氨酰胺酶和蛋白 酶 活 力均不断降低。持续调控酱醪ｐＨ 在６．５附近，处 于 谷氨酰胺酶和蛋白酶的最适ｐＨ 范围，有利于 保 留 酶 的活力，使原料分解得更充分。两个酱醪ｐＨ 发 酵 的 酱油其全氮、氨基酸态氮均在发酵初期快速上升，样 品间无显著性 差 异（Ｐ＞０．０５）。至 发 酵 第 ９０ 天，调 控ｐＨ 和自然ｐＨ 的全氮、氨氮均达到了特级酱油的 标准（全氮≥１．５０ｇ／ｄＬ，氨 基 酸 态 氮≥０．８０ｇ／ｄＬ）。 不同酱醪ｐＨ 发酵的酱油其肽分子量分布主要集中 于１～５ｋＤａ（＞５０％），不同肽段所占比例不同。至 发酵第９０天，调 控 ｐＨ 发 酵 酱 油 其 大 于５ｋＤａ肽 段 所占比例低于自然ｐＨ 发酵酱油，而具有重要 呈 味 作 用的１～５ｋＤａ肽 段 所 占 比 例 高 于 自 然 ｐＨ 发 酵 酱油，且差异显著（Ｐ＜０．０５）。不 同 酱 醪 ｐＨ 发 酵 的 酱 油的滋味有明显差异，调控ｐＨ 的鲜味、厚味、咸 味 最 为突出，苦味 最 弱；自 然 ｐＨ 的 甜 味 较 为 突 出，鲜 味、 厚味也较好，但有较强的 苦 味。调 控 酱 醪 ｐＨ 在６．５ 附近发酵的酱 油 相 对 于 自 然 酱 醪 ｐＨ 下 发 酵 的 酱 油 滋味更加浓郁。



 

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